抗前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin 9型（抗PCSK9）化合物及其用于治療和/或預(yù)防心 ...的制作方法
【專利說明】抗前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin9型（抗PCSK9)化 合物及其用于治療和/或預(yù)防心血管疾病的方法
[0001] 相關(guān)申請的的奪叉參考
[0002] 本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請?zhí)?1/789867的權(quán)益，其全部 內(nèi)容通過引用并入本文。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦咨助的研究或開發(fā)的聲明
[0004] 在國家心臟、肺和血液研究所（NHLBI)的支持下根據(jù)SBIR批準(zhǔn)號 1R43HL096167-01作出本發(fā)明。美國政府對本發(fā)明具有一定的權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin 9型（PCSK9)的生理作用 的化合物，包括其與低密度脂蛋白受體（LDLR)的相互作用。更具體地說，本發(fā)明涉及包含 PCSK9功能的小分子調(diào)節(jié)劑的組合物以及使用這些調(diào)節(jié)劑作為藥物的方法。PCSK9功能的 小分子調(diào)節(jié)劑可在治療上用于降低血液中的LDL-膽固醇水平，并且可以用于預(yù)防和/或治 療膽固醇和脂蛋白代謝紊亂，包括家族性高膽固醇血癥、導(dǎo)致動脈粥樣硬化的血脂異常、動 脈粥樣硬化，和更通常的，心血管疾?。–VD)。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 心血管疾病是導(dǎo)致死亡的原因，而動脈粥樣硬化是心血管疾病的首要原因。動脈 粥樣硬化是動脈的疾病并且導(dǎo)致與工業(yè)化國家的許多死亡相關(guān)的冠狀動脈心臟疾病?，F(xiàn) 在已確定冠狀動脈心臟疾病的幾個危險因素：血脂異常，高血壓，糖尿病，吸煙，不良飲食習(xí) 慣，缺乏運(yùn)動和壓力。血脂異常是血漿膽固醇（高膽固醇血癥）和/或甘油三酯（TGs)的提 高或低的高密度脂蛋白（HDL)水平，這促使動脈粥樣硬化發(fā)病。它是一種經(jīng)證明促進(jìn)心血 管疾病的代謝疾病。在血液中，膽固醇在脂蛋白顆粒中運(yùn)送，其中，低密度脂蛋白（LDL)膽 固醇（LDL-C)被認(rèn)為是"壞的"膽固醇，而HDL-膽固醇（HDL-C)被稱為"好的"膽固醇。由 于膽固醇對動脈粥樣硬化的影響，脂質(zhì)和脂蛋白異常在一般人群中極為常見，并且被認(rèn)為 是心血管疾病的高度可改變的危險因素。雖然用他汀類藥物治療（護(hù)理動脈粥樣硬化的現(xiàn) 行標(biāo)準(zhǔn)），60-70 %的心血管事件、心臟病發(fā)作和中風(fēng)發(fā)生，因此，存在關(guān)于CVD的長期感到 顯著未滿足的需求。此外，新的指南建議應(yīng)該實(shí)現(xiàn)更低的LDL水平以保護(hù)高危患者免受過 早的 CVD(l)。
[0008] 在PCSK9和膽固醇代謝之間的聯(lián)系建立之后，很快就發(fā)現(xiàn)PCSK9基因中的選定突 變引起常染色體顯性高膽固醇血癥（2)，這表明突變通過增加PCSK9的正常活動而賦予功 能獲得（gain-of-function) (3)。這通過野生型和突變PCSK9(S127R和F216L)在小鼠的肝 臟中高水平地表達(dá)的實(shí)驗得到支持；接受野生型或突變PCSK9的小鼠的肝LDLR蛋白水平急 劇下降（4,5)。未觀察到LDLR mRNA水平的相關(guān)降低，表明突變或野生型PCSK9的過表達(dá)通 過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制降低LDLR。
[0009] 由于PCSK9的功能獲得型突變導(dǎo)致高膽固醇血癥，那么產(chǎn)生功能缺失型突變是否 具有相反的效果并導(dǎo)致低膽固醇血癥的疑問是合乎情理的。在非裔美國人中確定了 PCSK9 的三個功能缺失型突變（6)。這些突變降低LDL-C水平28%，并顯示出降低CHD的頻率 (解釋為心肌梗塞，冠心病死亡或冠狀動脈血管重建）88%。Rashid等人（7)研究了其中 滅活PCSK9的小鼠中功能缺失型突變的機(jī)制。他們報告說，這些基因敲除小鼠顯示增加 的肝臟LDLR蛋白（而不是mRNA)，增加的循環(huán)脂蛋白的清除以及降低的血漿膽固醇水平。 PCSK9的天然存在的突變的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系分析也已經(jīng)提供了對PCSK9的作用機(jī)制的深刻理 解。有趣的是，被發(fā)現(xiàn)與LDL-C血漿水平的最大降低相關(guān)的PCSK9的突變是通過擾亂其合 成（Y142X)、自催化處理（L253F)或折疊（C679X)而防止成熟PCSK9分泌的那些（8)。Y142X 突變不產(chǎn)生可檢測的蛋白，因為其早在轉(zhuǎn)錄時發(fā)生并且據(jù)預(yù)計啟動無義介導(dǎo)的mRNA降解。 催化結(jié)構(gòu)域（L253F)的突變干擾蛋白質(zhì)的自催化切割。表達(dá)PCSK9-253F的細(xì)胞與表達(dá) PCSK9-WT的細(xì)胞相比，成熟蛋白質(zhì)的量降低，這表明突變抑制自催化切割。L253F突變接近 催化三聯(lián)體（PCSK9是一種絲氨酸蛋白酶），因此它可能干擾活性位點(diǎn)（8)。由于蛋白質(zhì)從 ER輸出需要PCSK9的自催化切割，L253F突變延遲PCSK9從ER傳輸?shù)郊?xì)胞表面。PCSK9中 的無義突變（C679X)，其截斷蛋白質(zhì)14個氨基酸，不干擾蛋白質(zhì)加工，但成熟蛋白在細(xì)胞中 積聚并且不分泌，這表明該蛋白正常地裂解但被錯誤折疊，并保留在ER中（8,9)。
[0010] 尚未完全闡明PCSK9引起LDLR降解的機(jī)制。然而，很明顯LDLR降解不需要PCSK9 的蛋白酶活性（10,11)。Li等人（10)已經(jīng)共同表達(dá)了前結(jié)構(gòu)域和反式的催化結(jié)構(gòu)域，并表 明所分泌的PCSK9無催化活性，但在降低細(xì)胞LDL攝取和LDLR水平方面它功能上等同于野 生型蛋白。McNutt等人（11)也報道了類似的研究。此外，Zhang等人（12)已經(jīng)繪制PCSK9 結(jié)合到LDLR的EGF-A重復(fù)，并且表明這樣的結(jié)合降低了受體回收并增加其降解。他們還報 道了與EGF-A結(jié)構(gòu)域的結(jié)合是鈣依賴性的，并且隨著pH從7降低到5. 2顯著地減少。最 近，Kwon等人（13)確定了與LDLR-EGF-AB(EGF-A和EGF-B)復(fù)合的PCSK9的晶體結(jié)構(gòu)。該 結(jié)構(gòu)顯示明確界定的EGF-A結(jié)構(gòu)域，但EGF-B結(jié)構(gòu)域是無序的并且未出現(xiàn)在它們的電子密 度圖中。EGF-A結(jié)構(gòu)域在遠(yuǎn)離催化位點(diǎn)的位點(diǎn)處與PCSK9催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且不與C末端 結(jié)構(gòu)域或前結(jié)構(gòu)域（14)接觸。
[0011] 已經(jīng)為靶向PCSK9提出了若干策略（15)。策略1 :mRNA基因敲除方法包括使用反 義寡核苷酸或RNAi。對小鼠施用的反義寡核苷酸將PCSK9表達(dá)降低了 >90 %并將血漿膽固 醇水平降低了 53% (16)。對食蟹猴單次靜脈注射在類脂質(zhì)（lipidoid)中遞送的RNAi將 血漿PCSK9水平降低了 70%并將血漿LDL-C水平降低了 56% (17)。策略2 :用小分子、肽 或針對PCSK9的抗體防止PCSK9與LDLR在細(xì)胞表面上結(jié)合。添加EGF-A片段到培養(yǎng)細(xì)胞 抑制外源添加的PCSK9介導(dǎo)LDLR降解的能力。策略3 :開發(fā)PCSK9加工的小分子抑制劑。 盡管有證據(jù)表明LDLR降解不需要PCSK9的催化活性（11)，PCSK9催化活性的細(xì)胞內(nèi)抑制劑 應(yīng)該是有效的，因為蛋白質(zhì)從ER分泌需要PCSK9的自催化加工。在其合成之后，PCSK9進(jìn) 行脫去前結(jié)構(gòu)域的自催化裂解反應(yīng)，但前結(jié)構(gòu)域仍然連接催化結(jié)構(gòu)域（18,19)。PCSK9的分 泌需要自催化加工步驟（20)，可能是因為前結(jié)構(gòu)域充當(dāng)分子伴侶和促進(jìn)折疊。前結(jié)構(gòu)域的 持續(xù)連接部分地阻斷PCSK9的底物結(jié)合口袋（18,19)。McNutt等人（21)證明分泌的PCSK9 的拮抗作用增加HepG2細(xì)胞中的LDLR表達(dá)。他們表明，導(dǎo)致功能獲得型突變的相關(guān)的 LDLR等位基因（H306Y)是由于PCSK9與LDLR的親和力增加，這將導(dǎo)致增強(qiáng)的LDLR破壞， 和降低的血漿LDL-C清除。另外，他們能夠優(yōu)雅地表明用LDLR(H306Y)亞片段阻斷分泌的 PCSK9導(dǎo)致培養(yǎng)IfepG2細(xì)胞的LDLR水平的增加。因此，PCSK9充當(dāng)引起LDLR降解的分泌因 子，并且干擾自催化過程的小分子抑制劑應(yīng)該減少成熟分泌的PCSK9的量。本發(fā)明涉及使 用策略2識別下調(diào)PCSK9的功能的小分子。
[0012] 最近（22-24)，Regeneron/Sanofi和Amgen已經(jīng)報道了證實(shí)單克隆抗體阻斷PCSK9 的第二階段概念驗證數(shù)據(jù)，作為使不受標(biāo)準(zhǔn)他汀類藥物治療控制的患者的LDL-C降低的策 略。他們報告說，單次注射他們的稱為REGN727的藥物，在臨床試驗中削減LDL水平超過 60%。他們的方法遵循使用抗體而不是小分子的策略2。該策略2也正由Merck、Novartis 和Pfizer公司進(jìn)行，而策略1正由Alnylam、Idera和Santaris進(jìn)行（25)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明涉及選擇性地與PCSK9功能相互作用并且下調(diào)PCSK9功能的小分子的治療 應(yīng)用。在第一實(shí)施方案中，在本發(fā)明的實(shí)行中使用的試劑具有下面的通式：
[0014]
[0015] 其中A選自由以下組成的組：
[0016]
[0017] 其中R1，R2和R3獨(dú)立地選自由H和任選取代的低級烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基、 雜環(huán)和雜芳基組成的組；R4選自由H、低級烷基、0H、SH、NH2、鹵素、CN、羰基、酰氨基（amido) 和羧酰氨基（carboxamido)組成的組；
[0018] X是（CH丄、0、S、N(R5)或價鍵；R5是H或低級烷基；以及n是1-3的整數(shù)；
[0019] M 是 CONH、NHCO、NHS02、NHC0N(R6)或價鍵；R6是 H 或低級烷基；
[0020] Q獨(dú)立地為CH或N ;
[0021] Z 是 CH2、S、0 或 NH;
[0022] m和p獨(dú)立地是0-1的整數(shù)；
[0023] B選自由C( = 0)和S( = 0)2組成的組；T選自由H、氨基、烷氧基、羧基，酰氨基、 氣基幾基、單烷基氣基幾基、^烷基氣基幾基、單烷基氣基亞橫醜基、^烷基氣基亞橫醜基、 單烷基氨基磺?；⒍榛被酋；⑼榛酋；被?、羥基磺酰氧基、烷氧基磺酰氧基、 烷基磺酰氧基、羥基磺?；⑼檠趸酋；⑼榛酋；榛?、單烷基氨基磺酰基烷基、二烷 基氨基磺酰基烷基、單烷基氨基亞磺?；榛⒍榛被鶃喕酋；榛腿芜x取代的低 級烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基、雜環(huán)和雜芳基組成的組；
[0024] &和R b獨(dú)立地代表H或者低級烷基，以及t，u，v和w獨(dú)立地是0-1的整數(shù)，前提 是v和w中的至少一個是0 ;
[0025] 及所述化合物的藥學(xué)上可接受的鹽和所有的立體異構(gòu)體。
[0026] 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在需要這種治療的患者中治療或預(yù)防高膽固醇 血癥和/或血脂異常、動脈粥樣硬化、CVD或冠狀動脈心臟疾病的至少一種癥狀的方法，包 括對這樣的患者施用治療有效量的具有以上式I的化合物。
[0027] 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及施用至少一種具有下式的化合物：
[0029] 其中，Het選自下組：
[0030]
[0031] 并且R2是任選取代的烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、雜環(huán)、雜環(huán)烷基、雜芳基和雜芳 基烷基，X選自NR。、0、S和到札的價鍵，并且R。是H或者低級烷基；
[0032] Z選自由S、0和CH2組成的組；
[0033] R1選自任選取代的烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜環(huán)、雜環(huán)烷基、雜芳基和雜芳基 烷基；
[0034] Ra，Rb，R'和R"獨(dú)立地選自H和低級烷基；
[0035] X^Y1和Z1相同或不同并且各自表示氫或選自由羥基、鹵素、氨基、單烷基氨基、二 烷基氨基、烷氧基、羧基、酰氨基（包括甲酰胺基、烷基酰氨基和芳基酰氨基）、氨基羰基、單 烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、氨基甲酸酯（carbamato)、羧酰氨基（carboxamido)、單燒 基氨基亞磺?；?、二烷基氨基亞磺?；?、單烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺?；?、烷基磺酰 基氨基、羥基磺酰氧基、烷氧基磺酰氧基、烷基磺酰氧基、羥基磺酰基、烷氧基磺?；?、烷基 磺?；榛瓮榛被酋；?