抗血栓形成移植物的制作方法
【專利說明】抗血栓形成移植物
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請有權(quán)根據(jù)35 U. S. C. § 119(e)要求于2013年5月20日提交的美國臨時專 利申請?zhí)?1/825, 256的優(yōu)先權(quán)，該申請以其整體通過引用并入本文。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明
[0004] 本發(fā)明是在政府支持下利用由國立衛(wèi)生研究所授予的HL083895完成的。政府在 本發(fā)明中擁有某些權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0005] 血管移植術(shù)是利用移植的血管或合成支架來替換、修復(fù)或繞過損傷的或潛在危險 的血管。血管移植物被植入到患有多種多樣疾病和病癥的受試者中，所述疾病和病癥包括 心血管疾病、動脈粥樣硬化、周圍性血管疾病、腹主動脈瘤等等。這些移植物可以改善或恢 復(fù)至其中流動被阻塞的區(qū)域的血流。盡管現(xiàn)在傳統(tǒng)地使用自體血管或由生物相容材料制成 的合成血管，但在使用脫細(xì)胞結(jié)構(gòu)作為血管移植物中已經(jīng)有了一些進(jìn)展。脫細(xì)胞血管移植 物保留了天然血管的形狀和結(jié)構(gòu)，但不含有細(xì)胞，由此使移植物的免疫原性最小化。各種脫 細(xì)胞生物學(xué)結(jié)構(gòu)正在被開發(fā)為小口徑血管移植物。目前它們的主要缺點(diǎn)是高促凝性，可以 通過利用宿主細(xì)胞將植入物的腔側(cè)再細(xì)胞化來降低高促凝性。然而，此解決方案意味著至 少一個月的患者專門等待時間，其原因是需要采集和擴(kuò)充自體內(nèi)皮細(xì)胞以襯于移植物腔。 對于剛出現(xiàn)的生物血管移植物（諸如組織工程的和天然脫細(xì)胞的移植物）的臨床應(yīng)用，在 需要的時候?qū)⑹强捎玫慕鉀Q方案對于臨床應(yīng)用來說是必不可少的。
[0006]因此，在本領(lǐng)域中存在對血管移植物的抗血栓形成涂層的需求。本發(fā)明滿足了這 種尚未被滿足的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 如下所述，本發(fā)明包括抗血栓形成組合物，諸如抗血栓形成血管移植物，所述組 合物包括涂覆有抗血栓形成涂層的脫細(xì)胞組織；制備抗血栓形成組合物的方法；和治療方 法，所述治療方法包括將所述抗血栓形成組合物植入需要所述治療方法的受試者中。
[0008] 本發(fā)明的一個方面包括一種組合物，所述組合物包括具有至少一個涂覆有抗血栓 形成涂層的表面的基底。
[0009] 另一個方面包括制備涂覆有抗血栓形成涂層的移植物的方法，包括以下步驟：提 供具有至少一個表面的基底；以及將所述至少一個表面涂覆以抗血栓形成涂層，其中所述 涂覆包括：向所述表面施加第一交聯(lián)溶液；以及向所述表面施加水凝膠溶液，由此在所述 基底的表面上提供第一層。
[0010] 在另一個方面，本發(fā)明包括治療受試者中的患病血管的方法，包括通過將抗血栓 形成血管移植物植入所述受試者中來繞過所述患病血管，所述抗血栓形成血管移植物包括 具有涂覆有抗血栓形成涂層的腔面的基底。
[0011] 在還另一個方面，本發(fā)明包括在受試者中提供血管通路的方法，包括將抗血栓形 成血管移植物植入所述受試者中，所述抗血栓形成血管移植物包括具有涂覆有抗血栓形成 涂層的腔面的基底。
[0012] 在本文中描述的本發(fā)明的上述方面或任何其它方面的各種實(shí)施方式中，抗血栓形 成涂層包括第一層，所述第一層包含水凝膠。在一個實(shí)施方式中，第一層包含透明質(zhì)酸，諸 如硫醇改性的透明質(zhì)酸。在另一實(shí)施方式中，第一層與基底的至少一個表面一一諸如基底 的腔面一一交聯(lián)。在又另一實(shí)施方式中，水凝膠溶液包含透明質(zhì)酸。
[0013] 在另一實(shí)施方式中，抗血栓形成涂層進(jìn)一步包括第二層，所述第二層包含抗凝劑， 其中第二層與第一層交聯(lián)。在一些包括第二層的實(shí)施方式中，第二層包含肝素。在另一實(shí) 施方式中，抗凝劑溶液包含肝素。
[0014] 在又另一實(shí)施方式中，基底是脫細(xì)胞組織，諸如脫細(xì)胞血管。在另一實(shí)施方式中， 脫細(xì)胞組織是具有腔面的脫細(xì)胞血管，并且其中抗血栓形成涂層被涂覆在脫細(xì)胞血管的腔 面上。
[0015] 在還另一實(shí)施方式中，涂覆進(jìn)一步包括向所述第一層施加第二交聯(lián)溶液并且向所 述第一層施加抗凝劑溶液，由此在所述第一層上面提供第二層。
[0016] 在還又另一實(shí)施方式中，受試者具有選自以下的病癥：周圍性血管疾病、動脈粥樣 硬化、動脈瘤和靜脈血栓形成。在一個實(shí)施方式中，受試者正在經(jīng)歷或預(yù)期要經(jīng)歷血液透 析。
【附圖說明】
[0017] 當(dāng)結(jié)合附圖閱讀時將更好地理解下面對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的詳述。為了舉例 說明本發(fā)明的目的，在附圖中顯示了目前優(yōu)選的實(shí)施方式。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不 限于在附圖中顯示的實(shí)施方式的準(zhǔn)確布置和手段。
[0018] 圖1是脫細(xì)胞移植物結(jié)構(gòu)的基于HA-肝素的涂層的示意性描述，所述細(xì)胞移植物 結(jié)構(gòu)使用巰基化-HA作為涂層的第一層和使用"端點(diǎn)（end-on) "胺化的肝素作為涂層的第 二層。
[0019] 圖2A描繪了對用于"端點(diǎn)"肝素改性的肝素改性和添加磺基-SMCC用于自發(fā)的肝 素交聯(lián)至涂覆透明質(zhì)酸的脫細(xì)胞血管的示意性描述。
[0020] 圖2B描繪了肝素改性的NMR表征。
[0021] 圖3是一組圖像，描繪了使用遞增濃度的SM(PEG) 12交聯(lián)劑（NHS-馬來酰亞胺交聯(lián) 劑）的涂覆HA的脫細(xì)胞豬腹主動脈的橫截切片。當(dāng)交聯(lián)劑的濃度增加時，涂層光滑度和厚 度也增加，如通過表面上厚度增加的藍(lán)色染料（甲苯胺藍(lán)）層和橙色染料層（Alamar Blue pH 1)所證明的。由甲苯胺藍(lán)和Alamar Blue pH 1(AB pH 1)兩者中的箭頭指示涂層。
[0022] 圖4是一組圖像，描繪了對照脫細(xì)胞大鼠腹主動脈（被脫細(xì)胞而沒有進(jìn)一步處理 的主動脈）、透明質(zhì)酸涂覆的脫細(xì)胞主動脈和透明質(zhì)酸-肝素逐層涂覆的主動脈的鳥瞰視 圖SEM圖像。
[0023] 圖5是描繪了 HA-肝素逐層涂覆的整個管狀脫細(xì)胞大鼠腹主動脈的SEM橫截切片 的圖像。可以在血管的腔側(cè)上清晰地看到涂層為幾微米厚的層，如由白色箭頭所指示的。
[0024] 圖6是一組圖像，描繪了整個管狀對照大鼠腹主動脈（沒有進(jìn)一步處理的脫細(xì)胞 主動脈）和透明質(zhì)酸-肝素逐層涂覆的脫細(xì)胞主動脈的組織學(xué)切片。這些切片用甲苯胺藍(lán)、 愛茜藍(lán)pH 1和愛茜藍(lán)PAS染色?？梢栽谘艿那粋?cè)上清晰地看到涂層為幾微米厚的層。
[0025] 圖7是在脫細(xì)胞對照大鼠腹主動脈、透明質(zhì)酸涂覆的和透明質(zhì)酸-肝素逐層涂覆 的脫細(xì)胞主動脈上孵育的分離自大鼠血液的血小板的一組SEM圖像。血小板和血栓形成在 對照上清晰可見。經(jīng)處理的血管顯示完全沒有血小板粘附。
[0026] 圖8是一組圖像，描繪了來自實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在所述實(shí)驗(yàn)中，血小板被鬼筆環(huán)肽染色 (其在血小板中產(chǎn)生紅顏色），在脫細(xì)胞對照大鼠腹主動脈和透明質(zhì)酸-肝素逐層涂覆的脫 細(xì)胞主動脈上孵育。在對照主動脈上血小板清晰可見。涂覆的主動脈顯示沒有血小板。
[0027] 圖9是描繪經(jīng)由X因子測定確定功能性表面肝素的圖，其中以反算的肝素當(dāng)量表 示肝素對X因子滅活的作用。測定的樣品為：脫細(xì)胞對照主動脈、新鮮切除的保留了連續(xù)層 的內(nèi)皮細(xì)胞的天然大鼠主動脈、培養(yǎng)的連續(xù)單層的HUVEC和透明質(zhì)酸-肝素涂覆的脫細(xì)胞 大鼠王動脈。
[0028] 圖10是描繪其中HUVEC被鋪在HA-肝素逐層涂覆的主動脈上并培養(yǎng)2周的實(shí)驗(yàn) 的結(jié)果的圖像。HUVEC細(xì)胞骨架用鬼筆環(huán)肽（紅色）染色且HUVEC核用DAPI (藍(lán)色）染色， 并且在10ym協(xié)議棧（z-stack)上成像。x和y軸顯示在圖像的側(cè)面上，其中看見HEVEC長 成了非平面單層。可以看到HUVEC侵入了涂層。
[0029] 圖11是顯示了在脫細(xì)胞豬主動脈上孵育的HA凝膠和HA-PEG交聯(lián)劑的恢復(fù)模量 (G'整圓）和損失模量（G"開口圓）被繪制為時間的函數(shù)的一組圖。組A和B顯示了在 沒有PEG交聯(lián)劑的情況下加載到脫細(xì)胞豬主動脈上的透明質(zhì)酸，并且其中彈性模量（G') 和損失模量（G")以Log(組A)或Ln (組B)針對時間作圖。組C和D顯示在添加PEG交 聯(lián)劑的情況下加載在脫細(xì)胞豬主動脈上的透明質(zhì)酸。彈性模量（G')和損失模量（G") 以Log(組C)或Ln(組D)針對時間作圖。使用上面的復(fù)合恢復(fù)模量方程，在凝膠的80% 聚合形式下，對于HA-PEG恢復(fù)模量G計算為37kPa，而對于不含PEG交聯(lián)劑的HA凝膠計算 為2kPa。對于涂層開發(fā)重要的是，HA-PEG凝膠在4小時孵育時間內(nèi)達(dá)到它們的成熟交聯(lián)形 式，而HA凝膠在23小時的孵育時間內(nèi)單獨(dú)達(dá)到成熟形式。這指示在血管內(nèi)HA凝膠的腔灌 注至少4小時后應(yīng)當(dāng)具有完全聚合的涂層。
[0030] 圖12是一組圖像，顯示了在37°C下對在PBS(組A)和新鮮抽取的大鼠血漿（組 B)下孵育2周的未涂覆的脫細(xì)胞大鼠主動脈對照（左手組圖像）和涂覆了透明質(zhì)酸/肝素 的脫細(xì)胞大鼠主動脈（右手組圖像）的穩(wěn)定性評價。經(jīng)PBS和大鼠血漿兩者孵育后，涂層 仍然存在并經(jīng)AB/PAS和甲苯胺藍(lán)染色可見。
[0031] 圖13是一組圖像，顯示了培養(yǎng)三天后用DAPI (藍(lán)色）和VE-鈣粘蛋白（紅色）染 色的接種在三種不同的沉積涂層上的HUVEC。涂層組分是生物相容的并且支持內(nèi)皮細(xì)胞在 體外短時期內(nèi)生長和增殖。
[0032] 圖14是一組圖像，顯示了在大鼠腹主動脈中端-對-端植入的大鼠-脫細(xì)胞移植 物在植入4周后的橫截切片。上組顯示了對照組的實(shí)施例，在該對照組中植入的移植物是 沒有進(jìn)一步改性的脫細(xì)胞大鼠主動脈。下組顯示了在大鼠腹主動脈中端-對-端植入的透 明質(zhì)酸涂覆的大鼠脫細(xì)胞移植物在植入后4周的實(shí)施例。所有切片用蘇木精和伊紅（H&E) 染色，其顯示近腔細(xì)胞在移植物內(nèi)的迀移以及對照組大鼠的大血凝塊內(nèi)的細(xì)胞沉積。
[0033] 圖15是一組圖像，顯示了在第4周時的外植體和在第4周時對移植物通暢性 (graft patency)的多普勒超聲成像評估。上組是對照脫細(xì)胞大鼠主動脈，而下組是透明質(zhì) 酸涂覆的脫細(xì)胞大鼠主動脈。根據(jù)多普勒超聲成像，對照植入物顯示沒有流動記錄，在多普 勒超聲成像中扁平線指示沒有流動。外植體的圖片顯示在植入物的中心形成的大纖維化血 凝塊阻止任何血流通過移植物。移植物也擴(kuò)張到其原始尺寸的20X，這指示移植物壁可能很 薄弱和大的吻合形成。另一方面，透明質(zhì)酸涂覆的大鼠脫細(xì)胞主動脈（下組）多普勒記錄 顯示了指示健康血管流量的典型大鼠脈動流和速度峰值為30cm/s的典型大鼠主動脈流量 讀數(shù)。外植體圖片顯示了沒有腔阻塞、凝塊和堵塞物，并且顯示移植物在2mm直徑的植入尺 寸范圍內(nèi)，這指示沒有擴(kuò)張。
[0034] 圖16是一組圖像，顯示了在犬頸動脈中端-對-側(cè)植入的脫細(xì)胞TEVG在植入4 周后的橫截切片。上組顯示了對照組的實(shí)施例，在對照組中植入的移植物是沒有進(jìn)一步改 性的脫細(xì)胞TEVG。下組顯示了透明質(zhì)酸涂覆的脫細(xì)胞TEVG的實(shí)施例。所有切片用蘇木精 和伊紅（H&E)染色。在涂覆的移植物中看到了沒有血凝塊和阻塞，并且在透明質(zhì)酸-肝素 涂覆的移植物上也可看到內(nèi)皮細(xì)胞的沉積。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 本發(fā)明涉及抗血栓形成涂層組合物，制備這種組合物的方法，和使用這種組合物 的方法。例如，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了涂覆有抗血栓形成涂層的血管移植物。本 發(fā)明基于下面的發(fā)現(xiàn)：將脫細(xì)胞血管的腔面涂覆以透明質(zhì)酸（HA)層或HA和肝素或其它分 子的多層涂層阻止血管中的血栓形成。因此，在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了抗血栓形成 血管移植物組合物，所述組合物包括脫細(xì)胞血管，其中所述血管的腔面涂覆以HA層。在另 一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了抗血栓形成血管移植物組合物，所述組合物包括脫細(xì)胞血管， 其中所述血管的腔面涂覆以多層涂層，其中至少一層包含HA并且至少一個其它層包含肝 素。在一個實(shí)施方式中，HA層與血管的腔面交聯(lián)。在一個實(shí)施方式中，肝素層與HA層交聯(lián)。 在某些實(shí)施方式中，涂層中的一層或多層包含水凝膠。在其它的實(shí)施方式中，HA層與其它 血液接觸表面結(jié)合，諸如在血管移植物或?qū)Ч苤邪乃芰?、或引?dǎo)血液的天然脈管系統(tǒng)。
[0036] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療方法，所述治療方法包括將本發(fā)明的抗血栓形成組合物 植入到受體中。例如，在一個實(shí)施方式中，該方法包括將HA-涂覆的或HA-肝素-涂覆的血 管移植物植入至需要所述治療方法的受試者中。涂覆的血管移植物可以用于，例如，治療具 有患病的或阻塞的血管的受試者。在某些實(shí)施方式中，涂覆的血管移植物用于治療動脈瘤 的方法。在另一實(shí)施方式中，涂覆的血管移植物用于繞過患病的或阻塞的血管的方法。在 另一實(shí)施方式中，涂覆的血管移植物用于在經(jīng)歷或預(yù)期要經(jīng)歷血液透析的受試者中提供血 管通路的方法。
[0037] 定義
[0038]除非另外定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普 通技術(shù)人員所普遍理解的含義相同的含義。盡管與本文所述的那些相似或等效的任何方法 和材料可以用于實(shí)施或測試本發(fā)明，但描述了優(yōu)選的方法和材料。
[0039] 如本文所使用，下面術(shù)語中的每一個具有在此部分中與其相關(guān)聯(lián)的含義。
[0040] 冠詞"一個（a)"和"一種（an)"在本文中用來指一個或多于一個（即，指至少一 個）該冠詞的語法對象。舉例而言，"一個要素"意指一個要素或多于一個要素。
[0041] 如本文所使用，當(dāng)術(shù)語"異常的"用于生物體、組織、細(xì)胞或其組分的語境中時，是 指與表現(xiàn)出"正常的"（預(yù)期的）各自特征的那些生物體、組織、細(xì)胞或其組分在至少一個可 觀察到的或可檢測到的特征（例如，年齡、治療或每天的時間）方面不同的那些生物體、組 織、細(xì)胞或其組分。對于一種細(xì)胞或組織類型來說是正常的或預(yù)期的特征對于不同的細(xì)胞 或組織類型可能是異常的。
[0042] 如本文所使用，當(dāng)"約"指可測量到的值諸如量、時間持續(xù)時間等時，意在涵蓋與指 定值的±20%或±10%，更優(yōu)選±5%，甚至更優(yōu)選±1%，且還更優(yōu)選±0. 1%的變化，因 為這些變化適合于實(shí)施公開的方法。
[0043] 如本文所使用，"減輕"疾病、缺陷、病癥或病況意指降低所述疾病、缺陷、病癥或病 況的一種或多種癥狀的嚴(yán)重性。
[0044] 如本文所使用，"抗凝劑"指阻止血液凝結(jié)或凝固的藥劑或一類藥劑。
[0045] 如本文所使用，"抗血栓形成涂層"指減少血栓或血凝塊形成的涂層。
[0046] 如本文所使用，"自體的"指來源于將在以后再引入其中的相同個體的生物學(xué)材 料。
[0047] 如本文所使用，"同種異體的"指來源于與所述材料將引入其中的個體相同的物種 的基因上不同的個體的生物學(xué)材料。
[0048] 如本文所使用，"生物相容的"指當(dāng)在哺乳動物中植入時不會引起所述哺乳動物中 的不良反應(yīng)的任何材料。當(dāng)被引入至個體中時，生物相容材料對該個體是無毒的或無害的， 其也不在哺乳動物中誘發(fā)對所述材料的免疫排斥。
[0049] 如本文所使用，術(shù)語"生物相容聚合物"和"生物相容性"當(dāng)與聚合物