治療糖尿病的新的口服藥用組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及新的包含胰島素肽或GLP-1肽的口服藥用組合物和生產(chǎn)這樣的組合 物的方法。
[0002] 背景 口服途徑是目前最廣泛使用的給藥途徑。然而，由于幾種屏障例如在胃腸（GI)道和腸 粘膜中的酶降解，以及經(jīng)由腸粘膜的不充分和易變化的吸收，肽和蛋白質(zhì)的給予常常限于 胃腸外途徑，而非優(yōu)選的口服給予。
[0003] 為克服該屏障，蛋白水解酶的滲透促進(jìn)劑和抑制劑通常包括在口服制劑中。
[0004] 長期以來，已經(jīng)提出了用于肽和蛋白質(zhì)的包含滲透促進(jìn)劑和蛋白酶抑制劑的口服 制劑，使得藥用活性肽或蛋白質(zhì)例如胰島素和GLP-1的口服吸收成為可能。然而，這并未證 明開發(fā)和制備藥品的口服固體制劑是無關(guān)緊要的。
[0005] 為口服給予肽和蛋白質(zhì)，已提議使用得自大豆的Bowman Birk (BBI)抑制劑作為 有用的蛋白酶抑制劑。
[0006] 用于口服遞送蛋白質(zhì)和肽的眾所周知的滲透促進(jìn)劑是癸酸或癸酸鈉。
[0007] Kyeongsoon Park et al在〃口服蛋白質(zhì)遞送：當(dāng)前狀態(tài)及未來展望（Oral protein delivery: Current status and future prospect)〃， Reactive & Functional Polymers，vol. 71，no. 3,（2011)第280-287頁中公開了用于開發(fā)口服蛋白質(zhì)遞送的 技術(shù)的綜述。W009118722 A2描述了包含蛋白質(zhì)和至少兩種蛋白酶抑制劑的組合物，US 2005/232981描述了浸入含有流化劑的疏水媒介中的水溶性組合物。
[0008] 然而，目前尚未提供關(guān)于如何通過使例如癸酸鈉與蛋白酶抑制劑混合來生產(chǎn)功能 性口服藥用組合物的信息。因此，仍有對(duì)用于口服遞送肽和蛋白質(zhì)的口服藥用組合物的需 求，其在給予胃腸道時(shí)有效提供給受試者治療有效血水平的治療活性肽成分。
[0009] 概述 本發(fā)明提供改進(jìn)的固體口服藥用組合物，其包含胰島素肽或GLP-1肽。此外或備 選地，本發(fā)明提供改進(jìn)的固體口服藥用組合物，其包含胰島素肽或GLP-1肽、癸酸鹽、 Bowman-Birk抑制劑（BBI)和BBI增溶劑。
[0010] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供改進(jìn)的固體口服藥用組合物，其包含胰島素肽或GLP-1 肽、至少10 mg癸酸鹽和至少1 mg BBI。在一個(gè)方面，本發(fā)明的固體口服藥用組合物包含 10 mg - 400 mg BBI 增溶劑。
[0011] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，增溶劑是糖醇例如山梨醇。
[0012] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，BBI的純度為至少90%。
[0013] 本發(fā)明也可解決根據(jù)示例性方面的公開內(nèi)容而變得顯而易見的的其它問題。
[0014] 描述 本發(fā)明涉及固體口服藥用組合物，其包含藥用活性肽或蛋白質(zhì)成分例如例如胰島素或 GLP-1肽、癸酸鹽例如癸酸鈉、和Bowman-Birk抑制劑（BBI)。
[0015] 如發(fā)明人在本申請(qǐng)中所述，BBI和癸酸鹽的成功組合并不是無關(guān)重要的，因?yàn)闈B透 促進(jìn)劑和蛋白酶抑制劑彼此相互作用，并且與治療活性肽成分相互作用。
[0016] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及固體口服藥用組合物，其包含：a)為胰島素肽或GLP-1 肽的活性肽成分，b)癸酸鹽例如癸酸鈉，c) Bowman-Birk抑制劑（BBI))，和d) BBI增溶劑， 例如糖醇，例如山梨醇或甘露醇。
[0017] 術(shù)語"癸酸"在此用來指式CH3(CH2)8C00H的飽和脂肪酸。癸酸的替代名稱包括： 十烷酸、正癸酸、正十烷酸、羊脂酸和正羊脂酸。
[0018] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，癸酸鹽是癸酸鈉。
[0019] 在一個(gè)方面，癸酸鹽是遞送劑，即用來口服遞送為肽或蛋白質(zhì)的活性成分的吸收 促進(jìn)劑。
[0020] 術(shù)語"遞送劑"在此用來表示促進(jìn)活性肽成分的腸道吸收，即增加滲透性差的肽藥 物的滲透性并由此改善口服藥物生物利用度的生物制品或化學(xué)制品。因此，經(jīng)口服途徑遞 送藥物主要受系統(tǒng)前降解和穿過腸道壁的差的滲透的限制。口服藥物遞送的主要挑戰(zhàn)之一 是開發(fā)促進(jìn)滲透性差的藥物穿過腸道上皮的吸收的新的劑型。
[0021] Bowman-Birk抑制劑（BBI)作為絲氨酸蛋白酶抑制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的。因此已知植物可含有各種絲氨酸蛋白酶抑制劑，這些抑制劑可被分為不同的家族。 Bowman-Birk抑制劑（BBI)屬于被廣泛研究的絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，其富含于雙子葉 和單子葉植物中。
[0022] BBI以第一個(gè)從大豆分離和鑒定該家族的成員的科學(xué)家的名字命名（Bowman DE， 大豆抗膜蛋白酶因子的區(qū)分（Differentiation of soy bean antitryptic factor)，Proc Soc Exp Biol Med 63: 547 - 550 (1946); Birk Y，Gertler A，Khalef S，一種從大豆分 離的純膜蛋白酶抑制劑（A pure trypsin inhibitor from soya bean)，Biochem J 87: 281 - 284 (1963))。BBI蛋白質(zhì)例如已經(jīng)在豆科植物（例如大豆、豌豆、扁豆、花生和鷹嘴 豆）和在禾本科植物中發(fā)現(xiàn)。BBI家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑通過采用典型的蛋白酶抑制 劑構(gòu)象的暴露的表面環(huán)與它們抑制的酶相互作用。產(chǎn)生的非共價(jià)復(fù)合物使蛋白酶失活。然 而，Bowman-Birk抑制劑蛋白質(zhì)的一個(gè)具體特征是，相互作用環(huán)（interacting loop)是一 個(gè)特別明確地限定的、二硫鍵連接的、短的β鏈區(qū)域。BBI家族的典型成員含有兩個(gè)這樣的 相互作用環(huán)，因而抑制至多兩個(gè)絲氨酸蛋白酶。BBI家族蛋白質(zhì)典型地由50-80個(gè)氨基酸組 成，并含有七個(gè)具有保守的二硫化物模式的二硫鍵。
[0023] 本文所用的術(shù)語"蛋白酶抑制劑"或"酶抑制劑"指抑制蛋白酶的功能的分子。在 本發(fā)明的一個(gè)方面，蛋白酶抑制劑抑制來自絲氨酸蛋白酶類型的蛋白酶（絲氨酸蛋白酶抑 制劑）。在本發(fā)明的一個(gè)方面，蛋白酶抑制劑抑制在哺乳動(dòng)物胃腸道中發(fā)現(xiàn)的胰酶。
[0024] 胰酶是存在于胰腺液中的酶，并包括脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶，例如胰蛋白酶、糜 蛋白酶、羧肽酶、彈性蛋白酶、胰脂肪酶、膽固醇酯酶、磷脂酶、各種核酸酶和胰淀粉酶。因 此，抑制哺乳動(dòng)物的胃腸道中發(fā)現(xiàn)的胰酶的蛋白酶抑制劑抑制酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白 酶、羧肽酶、彈性蛋白酶、胰脂肪酶、膽固醇酯酶、磷脂酶、各種核酸酶和/或胰淀粉酶。
[0025] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，蛋白酶抑制劑是以干擾肽/蛋白質(zhì)的降解的方式結(jié)合蛋白 水解酶的化合物。
[0026] -般來說，化合物可在許多不同的位點(diǎn)結(jié)合于蛋白水解酶，然而，在尋找蛋白水解 的抑制劑時(shí)，干擾蛋白水解酶功能的結(jié)合才是引人關(guān)注的。尋找抑制劑的最好方法是檢查 潛在抑制劑的存在對(duì)由提及的蛋白酶催化的酶促反應(yīng)的影響。酶動(dòng)力學(xué)描述了化合物抑 制酶的幾種可能性，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。酶抑制可以是例如競爭性的、非競爭性的、 混合的。區(qū)分不同種類的酶抑制的程序先前已見述于許多科學(xué)文章和大量的教科書，例如 Fundamentals of Enzyme Kinetics, Athel Cornish-Bowden ISBN-13: 978_3527330744〇 除了酶動(dòng)力學(xué)，蛋白水解酶與其抑制劑的相互作用通常通過許多不同的方法檢查，例如， X-射線晶體學(xué)、NMR光譜、許多光譜技術(shù)（熒光、圓二色性，UV-VIS)、質(zhì)譜、量熱法等，如本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的?；衔镆部赡軓?qiáng)烈地結(jié)合酶，但不影響催化反應(yīng)的速率。
[0027] BBI可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法獲得，例如通過重組生產(chǎn)或通過從植 物分離。
[0028] 本文可互換使用的術(shù)語" BBI"、" Bowman Birk"或" Bowman Birk抑制劑"指來自 絲氨酸蛋白酶抑制劑的Bowman Birk家族的抑制劑，例如但不限于：從栽培大豆（大豆）、 其它豆科植物或禾本科植物分離的Bowman Birk抑制劑，或在細(xì)胞基系統(tǒng)（例如但不限于 大腸桿菌（E. Coli)、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis))或植物基細(xì)胞培養(yǎng)物中重組表 達(dá)的Bowman Birk抑制劑。
[0029] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，Bowman Birk抑制劑從植物分離。在一個(gè)方面，Bowman Birk抑制劑從豆科植物中分離出來。在一個(gè)方面，Bowman Birk抑制劑從大豆或大豆部分 分離。用于從例如大豆或大豆部分分離BBI的方法是本領(lǐng)域已知的（例如Gladysheva， IP et al.，從不同的來源分離和鑒定大豆Bowman-Birk抑制劑（Isolation and characterization of soybean Bowman-Birk inhibitor from different sources)， Biochemistry (Mosc)，65 (2) :198-203 (2000) ; Garcia，MC et al.，大豆和相關(guān)產(chǎn) 品的組成和鑒定(Composition and Characterization of Soybean and Related Products), Critical Reviews in Food Science and Nutrition，37(4):361-391 (1997); Yeboah，NA et al.，使用疏水相互作用層析快速純化大豆Bowman-Birk蛋白酶 抑制劑的方法（A rapid purification method for soybean Bowman-Birk protease inhibitor using hydrophobic-interaction chromatography), Protein expression and purification 7(3): 309-314 (1996)，JP63051335-A、US4793996-A、W02003007976-A、 TO2011082338-A1)，或從商業(yè)來源購買。
[0030] 本文所用的BBI的純度是總BBI蛋白質(zhì)濃度、比活性（如通過糜蛋白酶抑制劑單 位/g蛋白質(zhì)測量的）和不存在作為BBI、毒素的拮抗劑起作用的成分或具有不僅僅是稀釋 效率/每單位量的BBI的有害的作用的其它成分的函數(shù)。一般來說，本公開的BBI產(chǎn)品的總 BBI蛋白質(zhì)濃度為至少約90 wt. %。典型地，本公開的BBI產(chǎn)品的總BBI蛋白質(zhì)濃度為至 少約90 wt. %、至少約91 wt. %、至少約92 wt. %、至少約93 wt. %、至少約94 wt. %、至 少約95 wt. %、至少約96 wt. %、至少約97 wt. %、至少約98 wt. %和至少約99 wt. %。
[0031] 在一個(gè)方面，當(dāng)本發(fā)明使用時(shí)，BBI具有由總BBI蛋白質(zhì)濃度代表的純度，其為至 少90 wt. %，如至少92 wt. %、94 wt. %或95 wt. %。在一個(gè)方面，BBI具有由總BBI蛋白質(zhì) 濃度代表的純度，其為至少96 wt. %，在一個(gè)方面，BBI具有為至少97 wt. %、至少98 wt. %或至少99 wt. %的純度。
[0032] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，總BBI蛋白質(zhì)濃度包含截短形式的BBI。截短形式的BBI具 有與BBI相同的序列，除了它們從其C-末端和/或N-末端起缺失1-15個(gè)氨基酸。在本發(fā) 明的一個(gè)方面，總BBI蛋白質(zhì)濃度無截短形式的BBI。
[0033] 如何測量用于本發(fā)明的BBI的純度，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。 純度可例如在一或二維SDS-PAGE凝膠電泳后和/或在RP-HPLC分離后測量。純度可如何 測量的一個(gè)非限制性實(shí)例是例如在本文實(shí)施例2中說明的。
[0034] 〃純〃單體蛋白在一或二維SDS-PAGE凝膠電泳后會(huì)產(chǎn)生單一的條帶，會(huì)從凝膠過 濾、高效液相層析（HPLC)或離子交換柱作為單對(duì)稱吸收峰洗脫，會(huì)產(chǎn)生單一組的質(zhì)譜、核 磁共振（NMR)或W吸收光譜信號(hào)，并且在適用時(shí)，會(huì)無污染酶活性。因?yàn)榻^對(duì)純度可能永遠(yuǎn) 無法建立，通常使用一個(gè)簡單的純度標(biāo)準(zhǔn)，即在SDS-PAGE后無法檢測到超過一個(gè)的單一蛋 白條帶（見 Mohan，純度和產(chǎn)率的測定（Determination of purity and yield). Methods in Molecular Biology，11，307-323 (1992))〇
[0035] 產(chǎn)品的BBI蛋白含量，即存在于本公開的產(chǎn)品中的BBI的量可通過本領(lǐng)域已知的 常規(guī)方法測定，包括例如層析法（例如，反相高壓液相層析（RP-HPLC)、尺寸排阻或凝膠滲 透HPLC、離子交換HPLC等）和/或光譜法（例如NMR、UV-VIS、⑶、IR等）和/或抗體基 方法（例如ELISA、LOCI、RIA等）和/或一般蛋白含量方法（例如Bradford方法，Lowry 方法，描述于Ohnishi，S. T.，和Barr，J. K.，一種使用雙縮脲和苯酸試劑定量蛋白的簡化 方法（A simplified method of quantitating proteins using the biuret and phenol reagents). Anal. Biochem.，86,193 (1978)等）。通過一般蛋白含量方法獲得的結(jié)果將 反映產(chǎn)品中存在的蛋白質(zhì)總量（也包含活性成分（API)，如果所述API來自蛋白質(zhì)并且為了 獲得BBI蛋白含量，API的量需要從這些方法獲得的結(jié)果中減去）。
[0036] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，Bowman Birk抑制劑在細(xì)胞基系統(tǒng)中重組表達(dá)。在本發(fā)明 的一個(gè)方面，在細(xì)胞基系統(tǒng)（例如但不限于大腸桿菌、枯草芽胞桿菌）或植物基細(xì)胞培養(yǎng) 物中重組表達(dá)Bowman Birk抑制劑。用于重組表達(dá)BBI的方法是本領(lǐng)域已知的（重組方 法的非限制性實(shí)例例如公開于Li N. et al.，在大腸桿菌中表達(dá)的大米Bowman-Birk抑制 劑的重折疊、純化和活性分析（The refolding, purification, and activity analysis of a rice Bowman-Birk inhibitor expressed in Escherichia coli). Protein Expr Purif. 1999 Feb;15(1):99-104 或 Vogtentanz Get al·， Protein Expr Purif. 2007 S??；55(1) :40-52)。
[0037] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包含至少10 mg癸酸鹽。在本發(fā)明的 一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包含至多450 mg癸酸鹽。在本發(fā)明的一個(gè)方面，固體口服 藥用組合物包含至多275 mg癸酸鹽。在本發(fā)明的一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包含至多 200 mg癸酸鹽。在本發(fā)明的一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包含約275 mg癸酸。在本發(fā)明 的一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包含10 mg和450 mg之間的癸酸鹽，在一個(gè)方面，包含10 mg和350 mg之間的癸酸鹽，在一個(gè)方面，包含10 mg和275 mg之間的癸酸鹽，和在一個(gè)方 面，包含10 mg和200 mg之間的癸酸鹽。
[0038] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包含至少1 mg BBI。在一個(gè)方面，固 體口服藥用組合物包含約10 mg BBI，在一個(gè)方面，包含約25 mg BBI，在一個(gè)方面，包含約 50 mg BBI，和在一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包含約200 mg BBI。在一個(gè)方面，固體口 服藥用組合物包含1 mg和200 mg之間的BBI，在一個(gè)方面，包含10 mg和200 mg之間的 BBI，在一個(gè)方面，包含25 mg和200 mg之間的BBI，和在一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包 含50 mg和200 mg之間的BBI。在一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包含1 mg和50 mg之間 的BBI，在一個(gè)方面，包含1 mg和25 mg之間的BBI，和在一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包 含1 mg和10 mg之間的BBI。在一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包含10 mg和50 mg之間 的BBI，在一個(gè)方面，包含10 mg和25 mg之間的BBI，和在一個(gè)方面，固體口服藥用組合物 包含25 mg和50 mg之間的BBI。
[0039] 本發(fā)明還覆蓋BBI增溶劑（例如糖醇）在固體口服藥用組合物中的用途。因此， 發(fā)明人已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，加入BBI增溶劑可增強(qiáng)體內(nèi)作用。
[0040] 術(shù)語"BBI增溶劑"在此用來指促進(jìn)BBI在體內(nèi)溶解的試劑。因此，所述試劑通過 促進(jìn)更有效的藥物釋放來提高活性肽成分在體內(nèi)的生物利用度。
[0041] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，BBI增溶劑是糖醇。在一個(gè)方面，BBI增溶劑是山梨醇或甘 露醇。
[0042] 當(dāng)在此使用時(shí)，術(shù)語"糖醇"意指具有通式H(HCH0)n+1H的碳水化合物的氫化形式。 因此糖醇是其羰基已被還原為伯或仲羥基的碳水化合物。示例性糖醇是例如山梨醇和甘露 醇。
[0043] 任何合適的糖醇可被包括在本發(fā)明的固體口服藥用組合物中。如本文所用的，用 于本發(fā)明的〃糖醇〃包括單糖、二糖和寡糖。示例性糖醇包括但不限于木糖醇、甘露醇、山 梨醇、赤蘚糖醇、乳糖醇、戊糖醇和己糖醇。示例性單糖包括但不限于葡萄糖、果糖，醛糖和 酮糖。示例性二糖包括但不限于蔗糖、異麥芽酮糖醇（isomalt)、乳糖、海藻糖和麥芽糖。示 例性寡糖包括但不限于麥芽三糖、棉子糖和麥芽四糖。在一個(gè)方面，糖醇是山梨醇、甘露醇 或木糖醇。在一個(gè)方面，糖醇是山梨醇。在一個(gè)方面，糖醇是二糖。在一個(gè)方面，糖醇是蔗 糖。
[0044] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包含至少10 mg BBI增溶劑。在本發(fā)明 的一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包含約275 mg BBI增溶劑。在本發(fā)明的一個(gè)方面，固體 口服藥用組合物包含至多400 mg BBI增溶劑。在本發(fā)明的一個(gè)方面，固體口服藥用組合物 包含10 mg和400 mg之間的BBI增溶劑，和在一個(gè)方面，包含10 mg和275 mg之間的BBI 增溶劑。在本發(fā)明的一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包含275 mg和400 mg之間的BBI增 溶劑。
[0045] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的固體口服藥用組合物被包含在劑型中。在一個(gè)方面，包含本 發(fā)明的固體口服藥用組合物的劑型是膠囊。
[0046] "劑型"在此被理解為意指物理形式，其中藥物被生產(chǎn)和分散，例如片劑、顆粒劑、 多顆粒劑、膠囊、丸粒、迷你片、包封丸粒、包封迷你片、包封微粒、小?；蛘衬ふ掣絼┬问?(例如片劑或膠囊）。
[0047] 在一個(gè)方面，包含本發(fā)明的固體口服藥用組合物的劑型是片劑. 在本發(fā)明的一個(gè)方面，包含本發(fā)明的固體口服藥用組合物的劑型包含具有腸溶衣的羥 丙基甲基纖維素（HPMC)膠囊。
[0048] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，癸酸鹽與BBI的比例（w/w)在300:1-1:1之間。
[0049] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，癸酸鹽與BBI的比例（w/w)在45:1-1:1之間，30:1-1:1之 間，9:1-1:1之間或5. 5:1-1:1之間。
[0050] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，癸酸鹽與BBI的比例（w/w)為約45:1，約30:1，約9:1，約 5. 5:1，或約 1:1。
[0051] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，癸酸鹽與BBI的比例（w/w)為約5. 5:1。
[0052] 固體口服藥用組合物 本發(fā)明的固體口服藥用組合物可包含包封成納米顆粒、微米顆粒、小粒、丸?；蚱渌N 類的多顆粒劑型的活性肽成分。上述口服藥用組合物系統(tǒng)可配制成片劑或填充到合適的硬 殼或軟殼膠囊中，其可被包衣以便以受控方式或在優(yōu)選的腸道部分釋放活性肽成分。
[0053] 在一個(gè)方面，固體口服藥用組合物包含小粒。在一個(gè)方面，術(shù)語"顆粒"指一種或 多種類型的小粒。在一個(gè)方面，術(shù)語"小粒"指聚集成較大顆粒的顆粒。
[0054] 在一個(gè)方面，固體口服藥用組合物呈現(xiàn)為固體劑型的形式。在一個(gè)方面，固體口服 藥用組合物呈現(xiàn)為片劑的形式。在一個(gè)方面，固體口服藥用組合物呈現(xiàn)為膠囊的形式。在 一個(gè)方面，固體口服藥用組合物呈現(xiàn)為小藥囊的形式。
[0055] 在一個(gè)方面，固體口服