使用工程改造的內(nèi)含肽生產(chǎn)肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生產(chǎn)肽的方法，所述方法包括將肽作為融合蛋白的一部分表達(dá)，其中 所述融合蛋白包含靶肽和工程改造的內(nèi)含肽。
[0002] 發(fā)明背景 肽是一類快速發(fā)展的治療劑，目前市場(chǎng)上有超過(guò)50種基于肽的產(chǎn)品，在涵蓋諸如免疫 學(xué)、腫瘤學(xué)、神經(jīng)病學(xué)和內(nèi)分泌學(xué)等疾病領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)中甚至更多。肽主要通過(guò)與特定細(xì)胞受 體的相互作用調(diào)節(jié)許多生理機(jī)能，籍此它們誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，例如神經(jīng)傳遞和激素 的釋放。由于其有限的體內(nèi)穩(wěn)定性和生物利用度所致，內(nèi)源性肽作為治療劑具有挑戰(zhàn)。然 而，高特異性和低毒性結(jié)合選擇性修飾和改進(jìn)肽的治療性質(zhì)的改進(jìn)能力提高肽在藥物研發(fā) 中的關(guān)聯(lián)性。
[0003] 在內(nèi)分泌學(xué)中，疾病常常由肽激素水平失衡引起或與之有關(guān)，正如諸如糖尿病和 肥胖癥等疾病中所見(jiàn)。值得注意的是，內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)中大約一半的肽激素在其C端是 酰胺化的，而α_酰胺部分對(duì)于生物活性和穩(wěn)定性常常是決定性的。某些治療性肽， 包括涉及肥胖癥和糖尿病的肽激素（例如肽ΥΥ(ΡΥΥ)、胰肽（ΡΡ)、α-降鈣素基因相關(guān)肽 (α-CGRP)、降鈣素（CT)和胰島淀粉樣多肽），需要在C端中的α-酰胺部分以獲得完整的 生物活性。
[0004]用于產(chǎn)生肽治療劑的最廣泛采用的技術(shù)是微生物表達(dá)系統(tǒng)和化學(xué)合成。雖然肽C 端酰胺容易通過(guò)化學(xué)合成獲得，但是不容易引入來(lái)源于缺乏α-酰胺化酶機(jī)制的微生物宿 主的重組肽中。因此，酰胺必須作為翻譯后修飾引入。
[0005]內(nèi)含肽是在單細(xì)胞生物中表達(dá)的在氨基端和羧基端兩端具有側(cè)翼蛋白質(zhì)序列的 自身催化性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。氨基端和羧基端序列被命名為外顯肽，這與外顯子和內(nèi)含子的 DNA命名法一致。內(nèi)含肽新興家族的一個(gè)看似典型的成員是蟾分支桿菌（ifycoAacteri? χ??Λ〇/^)的GyrA基因產(chǎn)物（ifreGyrA)。其分子量為約22kDa，在氨基端（半胱氨酸）和在 羧基端（組氨酸和天冬酰胺）含有多個(gè)決定性的氨基酸。另外，羧基端外顯肽必須始于半 胱氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。在完成翻譯后的某個(gè)點(diǎn)上，氨基端外顯肽和內(nèi)含肽間的肽鍵通過(guò) 涉及內(nèi)含肽氨基端半胱氨酸的N至S酰基轉(zhuǎn)移而轉(zhuǎn)化成硫酯鍵。該鍵然后在羧基端外顯肽 的開(kāi)端與親核殘基（絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸）交換，然后隨著天冬酰胺在內(nèi)含肽C端的 參與，內(nèi)含肽將自身切割出來(lái)，同時(shí)第二?；D(zhuǎn)移在氨基端和羧基端外顯肽之間產(chǎn)生天然 肽鍵。這些協(xié)同反應(yīng)的整體作用是兩個(gè)外顯肽無(wú)縫連接，且釋放出內(nèi)含肽。
[0006] 設(shè)計(jì)了突變型內(nèi)含肽，其中通過(guò)突變使自我剪接功能失效，以在氨基端或羧基端 剪接點(diǎn)任一個(gè)上允許切割。對(duì)于ifreGyrA內(nèi)含肽，通過(guò)N198A突變使得氨基端切割成為 可能。氨基端外顯肽被另一多肽序列即靶肽置換，使得在所得融合蛋白用親核化學(xué)劑（例 如2-巰基乙磺酸鈉（MESNa))切割后能夠制備具有反應(yīng)性羧基端α-硫酯柄（handle)的 靶肽。所述內(nèi)含肽來(lái)源的α-硫酯可與任何親核體反應(yīng)，并可用作用于化學(xué)連接、生物綴 合或酰胺化的化學(xué)柄（chemicalhandle)?；趦?nèi)含肽的方法已被用來(lái)重組生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室 規(guī)模的α-酰胺化的肽（TO98/50563A1;TO00/00625A1NottinghamI.R.等，Nat. Biotechnol. 2001， 19， 974-977)。
[0007] 應(yīng)用該技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)C端α-酰胺化肽的主要限制是通常觀察到的低產(chǎn)量，這 可歸因于大的內(nèi)含肽大小和內(nèi)含肽融合蛋白水解不穩(wěn)定性的組合。在ifreGyrA內(nèi)含肽中 引入T3C突變已表明與成熟前裂解降低有關(guān)（CuiC.等， 5? 7^-67)。此外，內(nèi)含肽的大小比肽激素的大小大，且內(nèi)含肽大小的降低通過(guò)更經(jīng)濟(jì)地利 用宿主蛋白質(zhì)合成機(jī)制，可潛在地改進(jìn)肽激素的最終產(chǎn)量。
[0008] 發(fā)明概述 本發(fā)明提供通過(guò)重組手段生產(chǎn)肽的方法。肽作為包含靶肽和工程改造的內(nèi)含肽的融合 蛋白的一部分表達(dá)，且在硫醇基誘導(dǎo)切割融合蛋白時(shí)，獲得靶肽的羧基端α-硫酯。羧基端 α-硫酯原則上可與任何親核體反應(yīng)，因此該策略允許更大范圍的羧基端修飾，例如化學(xué)連 接、生物綴合或酰胺化?；趦?nèi)含肽的策略的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是肽α-硫酯通過(guò)肽-內(nèi)含肽融 合蛋白的硫解作用產(chǎn)生，潛在地避免了對(duì)加工酶的需要。
[0009] -方面，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)肽的方法，所述方法包括將肽作為融合蛋白的一部 分表達(dá)的步驟，其中所述融合蛋白包含靶肽和內(nèi)含肽，其中所述內(nèi)含肽的大小被減到最小， 并且通過(guò)與ifreGyrA內(nèi)含肽（SEQIDΝ0:1)的3位對(duì)齊在相應(yīng)位置上攜帶半胱氨酸突變。
[0010] 另一方面，本發(fā)明提供包含靶肽和內(nèi)含肽的融合蛋白，其中所述內(nèi)含肽的大小被 減到最小，并且通過(guò)與ifreGyrA內(nèi)含肽（SEQIDΝ0:1)的3位對(duì)齊在相應(yīng)位置上攜帶半胱 氨酸突變。
[0011] 另一方面，本發(fā)明提供內(nèi)含肽，其大小被減到最小，并且通過(guò)與ifreGyrA內(nèi)含肽 (SEQIDNO: 1)的3位對(duì)齊在相應(yīng)位置上攜帶半胱氨酸突變。
[0012] 另一方面，本發(fā)明提供編碼包含至少靶肽和內(nèi)含肽的融合蛋白的DNA構(gòu)建體，其 中所述內(nèi)含肽的大小被減到最小，并且通過(guò)與ifreGyrA內(nèi)含肽（SEQIDN0:1)的3位對(duì)齊 在相應(yīng)位置上攜帶半胱氨酸突變。
[0013] 由于靶肽的低產(chǎn)量所致，采用基于內(nèi)含肽的方法的肽α-硫酯的重組生產(chǎn)限于實(shí) 驗(yàn)室規(guī)模，該方法涉及將靶肽作為內(nèi)含肽的氨基端融合物的表達(dá)。
[0014] 本發(fā)明的工程改造的內(nèi)含肽在大小上被減到最小，并且通過(guò)與ifreGyrA內(nèi)含肽 (SEQIDNO: 1)的3位對(duì)齊在相應(yīng)位置上具有半胱氨酸突變，導(dǎo)致融合蛋白的表達(dá)水平提高 和分離靶肽的產(chǎn)量較高，因此使本發(fā)明的方法適于生產(chǎn)規(guī)模。
[0015] 附圖簡(jiǎn)述 圖1:編碼在含有蛋白酶位點(diǎn)（SEQIDN0: 8)的氨基端標(biāo)簽（SEQIDN0: 4)和羧基 端GyrA內(nèi)含肽變體（SEQIDNO: 17)之間融合的[Gly4]-APYY4-36(SEQIDNO:10)的質(zhì) 粒1A的代表性pETlla載體圖。整個(gè)融合蛋白用特征蛋白質(zhì)1A標(biāo)記。描繪了NdeI、NheI、 NsiI、XhoI和BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。載體圖中還顯示了T7啟動(dòng)子區(qū)、氨芐西林抗性基 因、lacI阻抑物區(qū)和復(fù)制起點(diǎn)。
[0016] 圖2:制備羧基端修飾的靶肽的基本原理的代表性示意圖。使靶肽與可通過(guò)親核 切割釋放的羧基端內(nèi)含肽融合，產(chǎn)生作為α-硫酯、α-酰胺或具有合成羧基端片段的靶 肽。如本文所示，靶肽進(jìn)一步與氨基端親和標(biāo)簽融合，所述標(biāo)簽可以通過(guò)通過(guò)酶促切割除 去。該純化標(biāo)簽還可置于內(nèi)含肽的羧基端，避免對(duì)加工酶的需要。
[0017]發(fā)明描述 肽作為治療劑在包括代謝疾?。ɡ缣悄虿『头逝职Y）在內(nèi)的廣泛范圍的疾病中越來(lái) 越有益。包括涉及肥胖癥和糖尿病的肽激素（例如PYY、PP、a-CGRP、CT和胰島淀粉樣多 肽）的某些治療性肽在羧基端需要α-酰胺部分以獲得完整的生物活性。一個(gè)挑戰(zhàn)是通過(guò) 重組手段且特別是呈生產(chǎn)規(guī)模地生產(chǎn)所述肽。
[0018] 本發(fā)明提供工程改造的內(nèi)含肽，其在大小上被減到最小并在通過(guò)與ifreGyrA內(nèi)含 肽（SEQIDNO: 1)的3位對(duì)齊在相應(yīng)的位置上攜帶半胱氨酸點(diǎn)突變。內(nèi)含肽可用于肽的重 組生產(chǎn)，其中肽作為包含靶肽和本發(fā)明的工程改造的內(nèi)含肽的融合蛋白的一部分表達(dá)（參 見(jiàn)圖2)。通過(guò)與ifreGyrA內(nèi)含肽（SEQIDN0:1)的3位對(duì)齊在相應(yīng)的位置上的半胱氨酸突 變與內(nèi)含肽最小化的組合增加內(nèi)含肽融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)量及由此增加靶肽的產(chǎn)量。后者通 過(guò)如下獲得：融合蛋白的硫醇基誘導(dǎo)的切割產(chǎn)生靶肽的α-硫酯，其可通過(guò)加入銨親核體 (例如碳酸氫銨（ammoniabicarbonate))被轉(zhuǎn)化為祀肽相應(yīng)的α-酰胺。本發(fā)明的工程改 造的內(nèi)含肽因此提供產(chǎn)生α-酰胺化的肽激素（例如ΡΥΥ、ΡΡ、胰島淀粉樣多肽和a-CGRP) 的優(yōu)化策略。由于較高的表達(dá)產(chǎn)量和分離靶肽的較高產(chǎn)量，本發(fā)明因此提供以生產(chǎn)規(guī)模重 組生產(chǎn)α-酰胺化的肽的方法。
[0019] 通過(guò)該方法產(chǎn)生的α-硫酯還可用于化學(xué)連接或生物綴合，且一方面，本發(fā)明提 供用于重組生產(chǎn)羧基端生物綴合的蛋白質(zhì)和肽的方法。
[0020] -方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)肽的方法，所述方法包括將肽作為融合蛋白的一部 分表達(dá)的步驟，其中所述融合蛋白包含靶肽和內(nèi)含肽，其中所述內(nèi)含肽的大小被減到最小， 并且通過(guò)與ifreGyrA內(nèi)含肽（SEQIDΝ0:1)的3位對(duì)齊在相應(yīng)位置上具有半胱氨酸突變。 [0021 ] -方面，本發(fā)明提供包含靶肽和內(nèi)含肽的融合蛋白，其中所述內(nèi)含肽的大小被減 到最小，并且通過(guò)與ifreGyrA內(nèi)含肽（SEQIDΝ0:1)的3位對(duì)齊在相應(yīng)位置上攜帶半胱氨 酸突變。一方面，本發(fā)明提供內(nèi)含肽，其大小被減到最小，并且通過(guò)與ifreGyrA內(nèi)含肽（SEQ IDNO: 1)的3位對(duì)齊在相應(yīng)位置上攜帶半胱氨酸突變。一方面，本發(fā)明提供編碼包含靶 肽和內(nèi)含肽的融合蛋白的DNA構(gòu)建體，其中所述內(nèi)含肽的大小被減到最小，并且通過(guò)與ifre GyrA內(nèi)含肽（SEQIDNO: 1)的3位對(duì)齊在相應(yīng)位置上攜帶半胱氨酸突變。
[0022] 內(nèi)含妝是在單細(xì)胞生物表達(dá)的在氣基端和駿基端兩端具有側(cè)翼蛋白質(zhì)序列的 自身催化性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。一方面，內(nèi)含肽是GyrA內(nèi)含肽。GyrA內(nèi)含肽是一類被插入 編碼一些細(xì)菌的DNA促旋酶A亞基的基因序列內(nèi)的內(nèi)含肽，所述細(xì)菌通常為分支桿菌屬 (ifycoAacterii/a?)菌株。這類內(nèi)含肽由共享高序列同源性且特征為在氨基端具有Cys和在 羧基端具有His-Asn的16種不同的內(nèi)含肽組成。而且，所有這些內(nèi)含肽通過(guò)在氨基端-外 顯肽的羧基端中具有Tyr和羧基端-外顯肽的氨基端中具有Thr來(lái)識(shí)別。一般而言，這些內(nèi) 含肽的大小約420個(gè)氨基酸且氨基端和羧基端剪接區(qū)被D0D歸巢內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域中斷。 然而，GyrA內(nèi)含肽缺乏D0D回歸內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域，并且與其它GyrA內(nèi)含肽相比，在 氨基和羧基剪接結(jié)構(gòu)域之間具有較少量的殘基，這導(dǎo)致整體大小為198個(gè)氨基酸。該內(nèi)含 肽的X射線晶體結(jié)構(gòu)顯示，與氨基酸殘基107-164對(duì)應(yīng)的這個(gè)區(qū)由兩個(gè)α-螺旋以及非結(jié) 構(gòu)化區(qū)域組成，所述非結(jié)構(gòu)化區(qū)域從內(nèi)含肽特有的HINT剪接結(jié)構(gòu)域中突出出來(lái)并且不是 HINT剪接結(jié)構(gòu)域的一部分。
[0023] -方面，內(nèi)含肽是ifreGyrA內(nèi)含肽，其廣泛用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模以生產(chǎn)蛋白質(zhì)α-硫 酯用于化學(xué)連接目的。該內(nèi)含肽具有幾個(gè)有利的性質(zhì)（例如從細(xì)菌包含體中重折疊的能 力），在變性劑存在下保持活性和對(duì)氨基端-外顯肽的羧基端殘基的低序列要求。在SEQID NO: 1中顯示了ifreGyrA內(nèi)含肽的氨基酸序列。
[0024] -方面，內(nèi)含肽是通過(guò)切除殘基107-164的一部分或用序列GSGSGSGS的接頭置換 切除的殘基使大小減至最小的ifreGyrA內(nèi)含肽。
[0025] -方面，內(nèi)含肽是通過(guò)切除殘基107-160且用序列GSGSGSGS的接頭置換切除的殘 基被使大小減至最小的ifreGyrA內(nèi)含肽。
[0026] -方面，內(nèi)含肽是具有SEQIDN0: 20的序列的攜帶T3C突變的最小化的ifre GyrA內(nèi)含肽。
[0027] -方面，靶肽是在其羧基端被α-酰胺化的肽激素。全部哺乳動(dòng)物肽激素的大約 50%在其羧基端被α_酰胺化，這種α_酰胺官能團(tuán)對(duì)生物活性常常是決定性的。幾個(gè)肽 激素現(xiàn)今在代謝疾病例如糖尿病和/或肥胖癥的治療中用作藥物。實(shí)例為胰島淀粉樣多 肽（例如Symlin?，醋酸普蘭林肽，一種人胰島淀粉樣多肽的類似物）。人胰島淀粉樣多肽 是一種37個(gè)殘基α-酰胺化的肽激素，其可用于治療或預(yù)防糖尿病和/或肥胖癥。因此， 胰島淀粉樣多肽的羧基端需要被α-酰胺化以獲得完整的生物活性。同樣，PYY、PP、CT和 α-CGRP應(yīng)α-酰胺化以獲得完整的生物活性。羧基端α-酰胺部分還可用來(lái)保護(hù)不受蛋 白水解性降解。羧基端α-酰胺化和非酰胺化胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)的比較表明酰 胺化不影響所觀察到的對(duì)胰島素和胰高血糖素分泌的總體生物作用。然而，對(duì)于非酰胺化 變體，廣泛的羧基端降解發(fā)生在血漿中。因此，對(duì)于一些肽和蛋白質(zhì)，作為延長(zhǎng)全長(zhǎng)和生物 活性蛋白質(zhì)在血漿中的存在的手段引入羧基端酰胺化可能是有益的。本發(fā)明因此提供用于 獲得這樣的肽或蛋白質(zhì)的備選方法，所述肽或蛋白質(zhì)是針對(duì)生物活性被羧基端α-酰胺化 的或防止血漿中的羧肽酶降解的。
[0028] 靶肽作為羧基端α-硫酯從融合蛋白中釋放，這可通過(guò)親核?；〈磻?yīng)與許多 親核體反應(yīng)，本發(fā)明因此還提供用于生產(chǎn)范圍更廣的包含羧基端修飾的肽方法，所述羧基 端修飾例如通過(guò)化學(xué)連接、與生物學(xué)或非生物學(xué)部分生物綴合的肽延長(zhǎng)和酰胺化。
[0029] 肽ΥΥ(ΡΥΥ)和胰肽（ΡΡ)兩者屬于一類ΡΡ折疊家族的肽，神經(jīng)肽Υ(ΝΡΥ)也屬于 該家族。它們?nèi)鳛榫哂恤然缩０返?6個(gè)氨基酸肽天然分泌。它們的特征在于共同的 三維折疊，即ΡΡ折疊，其被視為對(duì)其生物功能是重要的穩(wěn)定元件。SEQIDΝ0: 2和SEQID NO: 14分別顯示了人ΡΥΥ(1-36)和人ΡΡ(1-36)的氨基酸序列。根據(jù)這些肽的某些在動(dòng)物 模型和人中顯示厭食作用，PP折疊肽或其類似物被提議用于治療肥胖癥和相關(guān)疾病。
[0030] 所謂PYY意指人肽激素及其物種變體。一方面，靶肽是PYY或其類似物。PYY在餐 時(shí)從遠(yuǎn)端小腸和結(jié)腸的L細(xì)胞中釋放。PYY作為PYY(1-36)釋放，但被二肽基肽酶IV(DPP IV)切割成PYY(3-36)，其構(gòu)成循環(huán)PYY的約50%。已知PYY(3-36)在GI道中具有外周作用， 還在中樞起飽滿感信號(hào)的作用。術(shù)語(yǔ)"人PYY"和"APYY"欲指SEQIDN0: 2的ΑΡΥΥ(1-36) 或備選SEQIDNO: 11的APYY(3-36)，其在1和2位具有氨基端氨基酸缺失。一方面，術(shù) 語(yǔ)PYY意指人PYY。一方面，靶肽是PYY(3-36)。一方面，靶肽是APYY(3-36)。一方面，靶 肽是PYY的類似物