具有抗帕金森作用的白術(shù)內(nèi)酯提取物、制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有抗帕金森作用的白術(shù)內(nèi)酯提取 物、制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 帕金森病（PD)是以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元漸進(jìn)性死亡為病理特征的中樞神經(jīng) 系統(tǒng)退行性疾病。目前治療手段主要以西藥為主，但只改善癥狀，不能控制其進(jìn)程，長期應(yīng) 用療效減弱且毒性增大。而中藥治療具有毒副作用小、協(xié)同作用強(qiáng)等優(yōu)勢而更具有開發(fā)前 景。
[0003] 白術(shù)為菊科植物白術(shù)J irac Ko i dz.的干燥根莖，具有 健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎的功效，素有補(bǔ)脾第一要藥之說，收載于歷版《中國藥 典》。白術(shù)內(nèi)酯類化合物在抗炎、抗腫瘤方面發(fā)揮著重要作用（KATSUYA END0，TAKASHI TAGUCHI,FUMIKO TAGUCHI,etc. Anti inflammation Principles of Atractylodes Rhizomes [J] · Chem. Pharm. Bull. , 1979, 27(12) : 2954-2958,沈國慶，何法霖，李鳳新等；白 術(shù)揮發(fā)油化學(xué)成分及抗腫瘤實驗研究[J]，北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009,32(6):413-415.)， 為白術(shù)發(fā)揮補(bǔ)脾功效的主要物質(zhì)。白術(shù)中的揮發(fā)油中主要成分為蒼術(shù)酮，研究表明蒼術(shù)酮 不具有抗帕金森作用，在光照情況下可以部分轉(zhuǎn)化為白術(shù)內(nèi)酯，但時間較長，而且易于揮 發(fā)。因此，我們對白術(shù)內(nèi)酯提取物的制備方法進(jìn)行了探索研究，并發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗帕金 森作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述問題，本發(fā)明提供具有抗帕金森作用的白術(shù)內(nèi)酯提取物、制備方法及應(yīng) 用，有效克服了現(xiàn)有技術(shù)獲得白術(shù)內(nèi)酯收率較低的不足，顯著降低生產(chǎn)成本，提高提取效 率，更加適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005] 為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供一種具有抗帕金森作用的白術(shù)內(nèi)酯提取 物，所述白術(shù)內(nèi)酯提取物含有白術(shù)內(nèi)酯I的重量百分比大于5%、白術(shù)內(nèi)酯II的重量百分比 大于10%和白術(shù)內(nèi)酯III的重量百分比大于20%，總內(nèi)酯的純度為重量百分比大于35%。
[0006] 本發(fā)明還提供一種具有抗帕金森作用的白術(shù)內(nèi)酯提取物的制備方法，包括以下步 驟。
[0007] 步驟1、白術(shù)藥材或飲片粉碎。
[0008] 步驟2、用氧化劑對白術(shù)粉中蒼術(shù)酮進(jìn)行氧化。
[0009] 步驟3、對氧化后白術(shù)粉進(jìn)行烘干干燥。
[0010] 步驟4、加入干燥所得白術(shù)粉質(zhì)量的1~5%鋅粒，然后對白術(shù)粉進(jìn)行至少一次提 取，得白術(shù)總內(nèi)酯提取液。
[0011] 步驟5、所述提取液液經(jīng)濃縮得到濃縮液。
[0012] 步驟6、所述的濃縮液經(jīng)干燥得白術(shù)內(nèi)酯提取物。
[0013] 所述具有抗帕金森作用的白術(shù)內(nèi)酯提取物作為制備抗帕金森藥物的應(yīng)用。
[0014] 所述步驟1中白術(shù)藥材或飲片粉碎成10~60目粉末。
[0015] 所述步驟2中氧化劑為臭氧和雙氧水。
[0016] 所述雙氧水的氧化條件為：（1)雙氧水的濃度：體積百分比為10~30% ; (2)雙氧 水的用量：質(zhì)量比為3:1~1:1 ; (3)浸潤時間：1~8h ; (4)反應(yīng)溫度：30~80°C ; (5)氧 化時間：2~24h。
[0017] 所述步驟3中烘干溫度為30~100°C。
[0018] 所述步驟6中干燥可采用減壓干燥、噴霧干燥、冷凍干燥。
[0019] 所述步驟4中內(nèi)酯的提取可采用溶劑回流提取法、超聲提取法、室溫浸提法、滲漉 法；提取所用的溶劑為甲醇、乙醇、丙酮等。
[0020] 具體以乙醇為例對提取條件說明如下。
[0021 ] (1)回流提取法：將氧化烘干后的白術(shù)粉，按照藥材質(zhì)量的5~12倍量加60~95% 乙醇(體積百分比)溶液，藥材質(zhì)量的1~5%倍量加入鋅粒，回流提取1~5h，提取兩次，合 并提取液，濾過，經(jīng)濃縮干燥得高含量白術(shù)內(nèi)酯提取物。
[0022] (2)超聲提取法：將氧化烘干后的白術(shù)粉，按照藥材質(zhì)量的5~12倍量加60~95% 乙醇(體積百分比)溶液，藥材質(zhì)量的1~5%倍量加入鋅粒，超聲提取10~50min，濾過，蒸 干，得白術(shù)內(nèi)酯提取物。
[0023] (3 )滲漉法：將氧化烘干后的白術(shù)粉，采用60~95%乙醇滲漉，滲漉體積為白術(shù)粉 質(zhì)量的10~20倍，濃縮干燥，得白術(shù)內(nèi)酯提取物。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果。
[0025] 本發(fā)明提供的具有抗帕金森作用的白術(shù)內(nèi)酯提取物、制備方法及應(yīng)用，通過向白 術(shù)藥材粉末中加入雙氧水或臭氧作為氧化劑，將白術(shù)揮發(fā)油中的主要成分蒼術(shù)酮等氧化成 白術(shù)內(nèi)酯類化合物，從而增加白術(shù)內(nèi)酯的含量；進(jìn)一步在提取過程中，在提取溶液中加入鋅 粒作為還原劑，保護(hù)生成的白術(shù)內(nèi)酯等化合物，使其避免被進(jìn)一步氧化而降解，有效增加白 術(shù)內(nèi)酯的提取率。該制備方法采用常見、安全的氧化劑對藥材中蒼術(shù)酮進(jìn)行氧化，并且氧化 劑反應(yīng)完成后殘留物為氧氣和水，環(huán)保無污染；并且，該制備方法簡便實用，易于操作，更適 合工業(yè)化生產(chǎn)，具有顯著的先進(jìn)性和實用價值。另外，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯具有抗帕金 森作用，可單獨(dú)或與其它藥物合用，應(yīng)用于制備抗帕金森的藥物，進(jìn)而治療帕金森病。
【附圖說明】
[0026] 圖1為白術(shù)藥材轉(zhuǎn)化前指紋圖譜。
[0027] 圖2為白術(shù)藥材轉(zhuǎn)化完成后指紋圖譜。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0029] 實施例1。
[0030] 本實施例提供一種具有抗帕金森作用的白術(shù)內(nèi)酯提取物，所述白術(shù)內(nèi)酯提取物含 有白術(shù)內(nèi)酯I的重量百分比為7. 5%、白術(shù)內(nèi)酯II的重量百分比為12. 3%和白術(shù)內(nèi)酯III的重 量百分比為25. 7%，總內(nèi)酯的純度為重量百分比為45. 5%。
[0031] 本實施例還提供具有抗帕金森作用的白術(shù)內(nèi)酯提取物的制備方法，包括以下步 驟。
[0032] 步驟1、取白術(shù)藥材50g，粉碎，過10目篩，得白術(shù)粉。
[0033] 步驟2、用雙氧水對白術(shù)粉中蒼術(shù)酮進(jìn)行氧化：采用體積百分比為20%的雙氧水 50mL，浸潤4h，在50°C下氧化8h。
[0034] 步驟3、所述白術(shù)粉氧化完成后，在40 °C下烘干12h。
[0035] 步驟4、對干燥后的白術(shù)粉置于IL圓底燒瓶中，加入500ml 95%乙醇，再加入Ig鋅 粒，回流提取lh，過濾，得白術(shù)總內(nèi)酯提取液。所述白術(shù)粉進(jìn)行提取時，為防止生成的白術(shù)內(nèi) 酯被繼續(xù)氧化，需要先加入鋅粒作為保護(hù)劑；所述鋅粒的加入量為干燥白術(shù)粉質(zhì)量的1~ 5% 〇
[0036] 步驟5、所述白術(shù)總內(nèi)酯提取液經(jīng)減壓濃縮或常壓濃縮得到濃縮液。
[0037] 步驟6、所述的濃縮液經(jīng)冷凍干燥得白術(shù)內(nèi)酯提取物。所得白術(shù)內(nèi)酯提取物收率為 10. 1% (重量比)。
[0038] 所得的白術(shù)內(nèi)酯提取物可以單獨(dú)或與其它藥物組合作為原料藥應(yīng)用于抗帕金森 的藥劑中。
[0039] 為進(jìn)一步驗證本發(fā)明的有益效果，提供以下實驗案例。
[0040] -、采用HPLC外標(biāo)方法測定白術(shù)內(nèi)酯的含量。
[0041 ] 1、HPLC 色譜條件：Agilent zorbax C18 (250mmX 4. 6mm，5 μ m)柱，二極管陣列檢 測器（DAD)，以乙腈-水為流動相梯度洗脫，梯度洗脫表如表1所示，流速：1. 0 ml/min ;進(jìn) 樣量：20 μ L ;柱溫：25°C。白術(shù)氧化波長變化程序表如表2所示。白術(shù)藥材轉(zhuǎn)化前指紋圖 譜如圖1所示，白術(shù)藥材轉(zhuǎn)化完成后指紋圖譜如圖2所示，其中，A為白術(shù)內(nèi)酯III的峰，B為 白術(shù)內(nèi)酯I的峰，C為白術(shù)內(nèi)酯II的峰，D為蒼術(shù)酮的峰。
[0042] 表1 :白術(shù)氧化工藝梯度洗脫程序表。
[0043] 表2 :白術(shù)氧化波長變化程序表。
[0044] 二、白術(shù)內(nèi)酯抗帕金森體外實驗。
[0045] 1、實驗材料：多巴胺能人神經(jīng)母瘤細(xì)胞株（SH-SY5Y細(xì)胞，購于中科院上海細(xì) 胞庫）；10%滅活小牛血清(購自GIBCO公司，批號：8166872);青霉素 lOOUmL1、鏈霉素 lOOyg.mL1 (購自 HyClone 公司，批號：J120721);DMEM F-12 1:1 培養(yǎng)液(購自 HyClone 公 司，批號：NXA0559);MPP+ (購于Sigma公司，批號：100M4713V);所用牛蒡苷和苷元取自本實 驗室。
[0046] 2、細(xì)胞培養(yǎng)：含10%滅活小牛血清、青霉素100U*mL \鏈霉素100 μ g*mL 1的DMEM F-12 1:1培養(yǎng)液培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中。隔天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng) 至單層細(xì)胞約80%匯合時，傳代培養(yǎng)，用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。
[0047] 3、造模及給藥方法：調(diào)節(jié)SH-SY5Y細(xì)胞密度約5 X 104/mL，100 μ L/孔接種于96孔 板，16h后分別加入不同濃度（1 μΜ、5 μΜ和10 μΜ)的牛蒡苷和牛蒡苷元，每一濃度設(shè)3個 復(fù)孔，并設(shè)等量的對照組(不含處理試劑）和模型組（只加 MPP+)，24h后，對照組加入完全培 養(yǎng)基，模型組和空白組每孔加入用培養(yǎng)液稀釋的ImM的MPP + (1 -甲基一 4 一苯基吡啶離 子)。
[0048] 4、四甲基偶氮唑鹽（MTT+)法檢測細(xì)胞存活率：48h后，不同組細(xì)胞每孔均加入 5mg/mL MTT+ 10 μ L，培養(yǎng)4h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加 DMSO 100 μ L，待結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo) 儀檢測490nm處各孔的吸收值（0D值）（參考波長620nm)，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率％ =(實驗組OD值一空白組OD值/對照組OD值一空白組OD值）X 100%。
[0049] 5、統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差分析（one-way AN0VA)進(jìn) 行統(tǒng)計學(xué)處理。
[0050] 6、結(jié)果。
[0051] 白術(shù)內(nèi)酯的活性測試結(jié)果如表3所示，表明白術(shù)內(nèi)酯提取物的抗帕金森活性強(qiáng)于 單體白術(shù)內(nèi)酯，并且白術(shù)內(nèi)酯II的活性較強(qiáng)。
[0052] 表3 :白術(shù)內(nèi)酯對MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用（均值土標(biāo)準(zhǔn)差，η = 3 )。
[0053] 注：##Ρ < 0. 01與空白對照組比較廣P < 0. 05與模型組比較ΓΡ < 0. 01與模型組 比較。
[0054] 三、白術(shù)內(nèi)酯提取物抗帕金森作用動物實驗。
[0055] 1、實驗材料：C57BL/6小鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，所用白術(shù)內(nèi)酯提取 物是按照實施例1自制，陽性藥司來吉蘭由深圳市中聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)。
[0056] 2、動物分組：將60只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為六組：空白組、模型組、陽性對照組 (司來吉蘭組）和低、中、高劑量白術(shù)內(nèi)酯提取物組(簡稱低、中、高劑量提取物組)，每組10 只。
[0057] 3、造模及給藥方法：低、中、高劑量提取物分別給藥20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg， 每天給藥一次，連續(xù)給藥13天。司來吉蘭組給藥劑量為15mg/kg。于給藥后第9天開始，模 型組、低、中、高劑量提取物組和司來吉蘭組皮下注射MPTP (1-甲基-4-苯基-1，2, 3, 6-四 氫P比啶（liethyl 4-phenyl tetrahydropyridine,購于 Sigma 公司，批號：1001054803) 25 mg/kg，每天一次，連續(xù)5天?？瞻捉M以腹腔注射等量生理鹽水代替MPTP，