一種減少蛋白質(zhì)聚體產(chǎn)生的蛋白制劑保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白制劑保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在過去的10年里，獲得批準(zhǔn)上市的治療性蛋白制劑新藥越來越多，而且高濃度 (50mg/ml以上）的適于皮下注射的蛋白制劑，因其使用方便已成為蛋白制劑的發(fā)展方向。 一般地，使用高于lmg/kg或者IOOmg/劑量的高劑量蛋白藥物給藥方案一般要求蛋白制劑 濃度達(dá)到幾十mg/ml以上，但是高濃度的蛋白制劑容易發(fā)生蛋白質(zhì)聚集，進(jìn)而影響藥物的 活性、藥物代謝動(dòng)力學(xué)以及藥物安全性。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)高濃度的蛋白溶液儲(chǔ)存于低溫（低于0°C )時(shí)，蛋白質(zhì)在反復(fù)凍融過 程中容易形成二聚體或多聚體。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)聚集的形成需要兩分子之間的 碰撞，而濃度與聚集的形成關(guān)系取決于聚集物的大小和結(jié)合機(jī)制，蛋白質(zhì)聚集可引起共價(jià) (例如二硫鍵連接）或非共價(jià)（可逆或不可逆）結(jié)合，由非共價(jià)結(jié)合引起的不可逆聚集通常 經(jīng)由可改變蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的由溫度、機(jī)械或化學(xué)過程暴露的疏水區(qū)域發(fā)生。
[0004] 目前已知有多種方法使蛋白制劑更加穩(wěn)定。例如，歐洲專利EP0599344A中描述 了通過加入諸如HSP25的熱激蛋白來提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。中國專利CN101745103B中報(bào) 道了添加飽和脂肪酸、L-精氨酸、還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽以提高白蛋白穩(wěn)定性。 歐洲專利EP0025275A描述含氮基質(zhì)的鹽如含精氨酸、胍或咪唑用于穩(wěn)定免疫球蛋白。其 它的方法還有：通過添加聚醚（歐洲專利EP0018609A)，通過添加甘氨酸、白蛋白以及硫酸 葡聚糖（美國專利US4808705)，通過添加去污劑T Ween20(德國專利DE2652636,英國專利 GB8514349)，通過添加十二烷基聚乙二醇（中國專利CN101007840)，通過添加檸檬酸緩沖 液（國際專利申請W09322335)，通過添加螯合劑（國際專利申請W09115509)等等，從而提 高蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性。雖然上述方法可使蛋白制劑具有一定的穩(wěn)定性，但沒有一種方法 適用于反復(fù)凍融時(shí)仍維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定，尤其是在蛋白質(zhì)再凍融、(TC以下低溫保存或凍干后 再加水溶解時(shí)能更好減少蛋白聚體生成的方法，目前尚未見報(bào)道。
[0005] 因此，如何有效減少蛋白制劑在冷凍和/或解凍時(shí)蛋白質(zhì)聚體的生成一直是本領(lǐng) 域急需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的申請人經(jīng)過大量的研究發(fā)現(xiàn)蛋白制劑中蛋白聚體的生成與制劑的冷凍 溫度密切關(guān)系，通過調(diào)節(jié)合適的冷凍溫度，可有效減少蛋白制劑中蛋白聚體的形成，從而完 成本發(fā)明。具體地，本發(fā)明公開了：
[0007] 1. -種蛋白制劑保存方法，其特征在于，所述蛋白制劑冷凍溫度為：零下40攝氏 度到零下196攝氏度。
[0008] 2.根據(jù)上述1所述的方法，其特征在于，所述蛋白制劑的冷凍溫度為：零下40攝 氏度到零下80攝氏度。
[0009] 3.根據(jù)上述2所述的方法，其特征在于，所述蛋白制劑的冷凍溫度為：零下80攝 氏度。
[0010] 4.根據(jù)上述1-3任一所述的方法，其特征在于，所述蛋白制劑的解凍溫度為：4攝 氏度到37攝氏度。
[0011] 5.根據(jù)上述1-3任一所述方法，其特征在于，所述制劑的蛋白質(zhì)濃度大于5mg/ml。
[0012] 6.根據(jù)上述5所述方法，其特征在于，所述制劑的蛋白質(zhì)濃度大于50mg/ml。
[0013] 7.根據(jù)上述1-3任一所述方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)為抗體或者融合蛋白。
[0014] 8.根據(jù)上述7所述方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)為融合蛋白。
[0015] 9.根據(jù)上述8所述方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)為TNFR-FC融合蛋白。
[0016] -般蛋白質(zhì)制劑在大約-20°C以下已可以完全冷凍，因此人們一般會(huì)在-20°C的 環(huán)境下將蛋白質(zhì)制劑冷凍保存。蛋白制劑的解凍過程則是蛋白冷凍過程的反向過程，如果 解凍的溫度過高有可能造成蛋白聚體的增加，但同時(shí)解凍的溫度比較低，那么解凍時(shí)間會(huì) 比較長也有蛋白聚體增加的可能，一般選擇4-37度進(jìn)行解凍。
[0017] 我們的研究人員經(jīng)過大量的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白制劑隨著冷凍溫度的增加，蛋白聚體 也會(huì)增加。通過進(jìn)一步的研究，我們發(fā)現(xiàn)，蛋白制劑冷凍溫度為零下40攝氏度到零下196 攝氏度，優(yōu)選零下40攝氏度到零下80攝氏度，最優(yōu)選零下80攝氏度，可有效減少蛋白制劑 在冷凍和/或解凍時(shí)蛋白質(zhì)聚體的生成。具體見本發(fā)明的具體實(shí)施例。
[0018] 本發(fā)明所述的蛋白聚體是指：分子量至少是單體蛋白分子量2倍的蛋白聚集物， 其含量可以用SEC-HPLC方法測定。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
[0020] 檢測儀器和方法
[0021] 按現(xiàn)行版《中國藥典》三部附錄III B項(xiàng)"高效液相色譜法"測定。
[0022] 高壓液相色譜儀：Dionex Ultimate3OOO
[0023] 色譜柱：親水硅膠體積排阻色譜柱，排阻極限500kD，孔徑烈0Λ，粒度5 μ m，柱內(nèi) 徑 7. 8_，柱長 30cm ;選用 Tskgel G3000SWXL
[0024] 流動(dòng)相為200mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH6. 6-7. 0 ;上樣量10~40 μ g，檢測波長 280nm。按峰面積歸一化法計(jì)算
[0025] 實(shí)施例1蛋白制劑在不同冷凍溫度下的蛋白聚體生成實(shí)驗(yàn)
[0026] 樣品I =TNFR-FC蛋白溶液（濃度39mg/ml)(來源蘇州康寧杰瑞生物科技有限公 司）
[0027] 取5個(gè)1000 ml離心瓶，在離心瓶分別倒入550ml樣品1，分別把這些裝好蛋白的離 心瓶置于-201：、-401：、-701：、-801：冰箱中和液氮（一196°〇中冷凍，液氮冷凍好后放 置在-20度的冰箱中48小時(shí)，然后分別將上述冷凍的蛋白溶液在30度水浴中進(jìn)行化凍，然 后用SEC-HPLC法檢測各化凍蛋白溶液的蛋白聚體生成情況，檢測結(jié)果見表1 :
[0028] 表1不同冷凍溫度下的蛋白聚體生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0029]
[0030] 從表1可以看出，零下40攝氏度到零下196攝氏度條件下對蛋白溶液進(jìn)行凍存， 其蛋白聚體增加均比常規(guī)的零下20攝氏度凍存的蛋白聚體生成少，尤其是在-80°C進(jìn)行冷 凍時(shí)，蛋白聚體減少了近36%。
[0031] 實(shí)施例2不同濃度蛋白制劑在不同冷凍溫度下的蛋白聚體生成實(shí)驗(yàn)
[0032] 樣品2 :TNFR-FC蛋白溶液（濃度5mg/ml)(來源蘇州康寧杰瑞生物科技有限公司）
[0033] 樣品3 :TNFR-FC蛋白溶液（濃度50mg/ml)(來源蘇州康寧杰瑞生物科技有限公 司）
[0034] 拿3個(gè)500ml離心瓶，在離心瓶分別倒入200ml的樣品2蛋白溶液，同時(shí)，再拿3 個(gè)500ml離心瓶，然后在離心瓶分別倒入200ml的樣品3蛋白溶液，然后分別把上述6個(gè)裝 好蛋白溶液的離心瓶置于-20度，-40度，-80度的冰箱中，冷凍過夜。冷凍完畢后,置于室 溫水浴化凍。用SEC-HPLC方法檢測已化凍溶液的聚體情況，同時(shí)用SEC-HPLC法檢測沒經(jīng) 過凍存的原樣品2和樣品3溶液的聚體情況作為對照，檢測結(jié)果見表3。
[0035] 表3不同濃度蛋白制劑在不同冷凍溫度下的蛋白聚體生成情況表
[0036]
[0037] 由上表可以看出5mg/ml的蛋白溶液-20°C凍存后化凍液的蛋白聚體比原溶液的 蛋白聚體增加了 28%，而-80°C凍存后的化凍液蛋白聚體僅比原溶液增加了 9 % ;另外， 50mg/ml的蛋白溶液-80°C冷凍后化凍液蛋白聚體僅是-20°C冷凍后化凍液蛋白聚體的 65%。可見相比常規(guī)的-20°C凍存，_40°C或_80°C條件下冷凍保存蛋白溶液，蛋白聚體的生 成均有減少，且蛋白溶液濃度越高效果越明顯。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蛋白制劑保存方法，其特征在于，所述蛋白制劑冷凍溫度為：零下40攝氏度到 零下196攝氏度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白制劑的冷凍溫度為：零下40攝 氏度到零下80攝氏度。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白制劑的冷凍溫度為：零下80攝 氏度。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述蛋白制劑的解凍溫度為：4攝 氏度到37攝氏度。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述方法，其特征在于，所述制劑的蛋白質(zhì)濃度大于5mg/ml。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述制劑的蛋白質(zhì)濃度大于50mg/ml。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)為抗體或者融合蛋白。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)為融合蛋白。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)為TNFR-FC融合蛋白。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種減少蛋白質(zhì)聚體產(chǎn)生的蛋白制劑保存方法，其特征在于，所述蛋白制劑冷凍溫度在零下40攝氏度到零下196攝氏度。該方法可有效減少蛋白制劑在凍融過程中蛋白二聚體或多聚體的形成。
【IPC分類】A61K39/395, A61K38/00
【公開號】CN105267964
【申請?zhí)枴緾N201410323054
【發(fā)明人】胡輝, 朱云斌, 貢以捷
【申請人】上海中信國健藥業(yè)股份有限公司
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2014年7月8日