一種iNGR修飾的腦膠質(zhì)瘤靶向自組裝RNAi納米給藥系統(tǒng)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新型基因藥物遞送系統(tǒng)及其制備方法，具體涉及一種iNGR修飾的腦膠質(zhì)瘤靶向自組裝RNAi納米給藥系統(tǒng)及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)報道了腦膠質(zhì)瘤是最具破壞性的人類疾病之一。傳統(tǒng)的治療手段(如:手術(shù)切除、放療、化療等)普遍存在不可避免的副反應(yīng)，效果欠佳且復(fù)發(fā)率高。有研究顯示，RNA干擾(RNAi)治療可以顯著降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)特定功能蛋白的表達(dá)從而抑制疾病的發(fā)生發(fā)展，并伴隨極少的副反應(yīng)，已被廣泛接受為目前治療腦膠質(zhì)瘤最為安全有效的方法。常見的RNAi治療是通過陽離子聚合物包封小干擾RNA (siRNA)實現(xiàn)的，然而，相對有限的包封效率、潛在的免疫反應(yīng)、難生物降解的毒性以及非特異性的器官蓄積等明顯限制了其在腦膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域的臨床應(yīng)用。因此，為了實現(xiàn)更為安全有效的腦膠質(zhì)瘤治療，亟需設(shè)計開發(fā)一種特異性腦膠質(zhì)瘤靶向的內(nèi)源性高載藥RNAi納米給藥系統(tǒng)。
[0003]研究報道，滾環(huán)轉(zhuǎn)錄(RCT)是一種獨特的體外RNA聚合反應(yīng)，AUCG四種核苷酸以特定序列的引物分子為模板，在RNA聚合酶的作用下，不斷重復(fù)轉(zhuǎn)錄過程，形成一系列連續(xù)的小發(fā)夾RNA (shRNA)，并通過自組裝折疊形成海綿狀疏松的RNAi納米球(直徑約500nm)。RNAi納米球自身既為載體又為藥物，可攜帶大量siRNA序列入胞，而后胞內(nèi)固有的酶切機(jī)制可將其生物降解為數(shù)百萬siRNA，充分發(fā)揮RNAi的治療作用。同時，由于RNA本身為人體內(nèi)源性物質(zhì)，可有效避免體內(nèi)免疫反應(yīng)，因此，該RNAi納米球是一種極具潛力的RNAi納米給藥系統(tǒng)。
[0004]為延長RNAi納米球在血液中的循環(huán)時間，實現(xiàn)顯著的EPR效應(yīng)，增加腫瘤部位蓄積量，RNAi納米給藥系統(tǒng)需保持在特定的粒徑范圍。以0ΕΙ.為聚合單元、DTSSP為linker，人工合成的聚合物pOEI (Mwl8000)是一種谷胱甘肽敏感的陽離子聚合物，含有豐富的氨基末端及正電性，可將海綿狀疏松的RNAi納米球壓縮至理想粒徑范圍(直徑約lOOnm)，且在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度谷胱甘肽的環(huán)境中可被特異性降解為0ΕΙ.片段，重新暴露海綿狀疏松的RNAi納米球于腫瘤細(xì)胞酶切環(huán)境中，以實現(xiàn)后續(xù)的生物降解。因此，pOEI聚合物是一種極具潛力的還原敏感性RNAi納米球壓縮材料。
[0005]研究還顯示，血管生成在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵性作用。與正常血管相t匕，新生血管表面大量特異性功能蛋白過表達(dá)，可被廣泛開發(fā)應(yīng)用為腫瘤靶向的新靶點。然而，對于有效的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)，僅具備新生血管表面靶向特性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，能夠?qū)崿F(xiàn)高效的血管滲出、穿透腫瘤組織、到達(dá)腫瘤細(xì)胞才是關(guān)鍵。
[0006]基于本領(lǐng)域現(xiàn)狀，本申請的發(fā)明人擬利用RCT技術(shù)設(shè)計合成可攜帶大量siRNA序列的自組裝RNAi納米球，構(gòu)建一種新型高效的RNAi納米給藥系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種新型基因藥物遞送系統(tǒng)及其制備方法，具體涉及一種iNGR修飾的腦膠質(zhì)瘤靶向自組裝RNAi納米給藥系統(tǒng)及其制備方法。本發(fā)明利用RCT技術(shù)設(shè)計合成可攜帶大量siRNA序列的自組裝RNAi納米球，構(gòu)建了一種新型高效的RNAi納米給藥系統(tǒng)。
[0008]本發(fā)明利用人工合成的谷胱甘肽敏感的陽離子聚合物，對海綿狀疏松的RNAi納米球進(jìn)行壓縮，并通過親水性聚合物修飾，構(gòu)建了具備理想粒徑且還原敏感的RNAi納米給藥系統(tǒng)。
[0009]本發(fā)明所述的iNGR是一種環(huán)狀的腫瘤穿透多肽，其結(jié)構(gòu)包括新生血管歸巢片段、腫瘤穿透片段及可識別的酶切位點三個有機(jī)部分，可特異性識別腦膠質(zhì)瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面過表達(dá)的neuropilin-1 (NRP-1)受體,在新生血管表面被特定蛋白酶水解,進(jìn)而特異性識別腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面過表達(dá)的CD13受體，完成深入有效的腦膠質(zhì)瘤靶向功能。
[0010]本發(fā)明利用iNGR腫瘤穿透環(huán)肽對RNAi納米給藥系統(tǒng)進(jìn)行修飾，以增加其在腦膠質(zhì)瘤部位的蓄積，實現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤靶向的RNAi治療。
[0011 ] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0012]本發(fā)明的腦膠質(zhì)瘤靶向自組裝RNAi納米給藥系統(tǒng)由iNGR修飾的谷胱甘肽敏感的陽離子聚合物靶向壓縮材料與海綿狀疏松的RNAi納米粒復(fù)合制得；
[0013]所述的靶向壓縮材料由谷胱甘肽敏感的陽離子聚合物，親水性聚合物和iNGR環(huán)肽三者通過共價連接方式制得，其中，親水性聚合物與陽離子聚合物的分子比是10:1，iNGR環(huán)肽與陽離子聚合物的分子比為5:1，靶向壓縮材料與海綿狀疏松的RNAi納米粒復(fù)合質(zhì)量比為10:1。
[0014]本發(fā)明進(jìn)一步提供了腦膠質(zhì)瘤靶向自組裝RNAi納米給藥系統(tǒng)的制備方法:其包括:
[0015]谷胱甘肽敏感的陽離子聚合物和親水性聚合物以1:10的分子比溶于pH值8.0的磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS)中，室溫攪拌2h，兩種分子中含有的基團(tuán)發(fā)生特異性反應(yīng)，生成谷胱甘肽敏感的陽離子聚合物-親水性聚合物，超濾法除去未反應(yīng)的親水性聚合物，再將iNGR環(huán)肽以5:1的分子比，與谷胱甘肽敏感的陽離子聚合物-親水性聚合物上的特異基團(tuán)在pH值7.2的PBS中室溫攪拌反應(yīng)2h后，生成靶向壓縮材料(谷胱甘肽敏感的陽離子聚合物-親水性聚合物-1NGR環(huán)肽)，超濾法除去未反應(yīng)的iNGR環(huán)肽；制得的靶向壓縮材料溶于等滲PBS中，與海綿狀疏松的RNAi納米粒以質(zhì)量比為10:1的比例，渦旋復(fù)合30秒，得腦膠質(zhì)瘤靶向自組裝RNAi納米給藥系統(tǒng)。
[0016]本發(fā)明中，所述的腦膠質(zhì)瘤靶向自組裝RNAi納米給藥系統(tǒng)中，靶向頭基為高腫瘤新生血管靶向、高腫瘤組織穿透的iNGR環(huán)肽。
[0017]本發(fā)明中，所述的谷胱甘肽敏感的陽離子聚合物單體為分子量800的分枝狀乙烯亞胺低聚物(branched oligoethylenimine,簡稱0ΕΙ),每兩個單體由3，3’- 二硫代雙(磺酸玻拍酷亞氨基丙酸酯)(3，3’ -Dith1bis (sulfosuccinimidylprop1nate),簡稱 DTSSP)連接，構(gòu)成ΡΟΕΙ谷胱甘肽敏感的陽離子聚合物。
[0018]本發(fā)明中，所述親水性聚合物為雙功能的聚乙二醇(polyethyleneglycol,簡稱PEG)。
[0019]本發(fā)明中，所述的海綿狀疏松的RNAi納米粒為通過RCT技術(shù)體外合成的可攜帶大量siRNA序列的RNAi納米粒，在細(xì)胞內(nèi)源性酶切作用下可產(chǎn)生數(shù)百萬siRNA。
[0020]本發(fā)明所制備的腦膠質(zhì)瘤靶向自組裝RNAi納米給藥系統(tǒng)適用于介導(dǎo)所有新生血管表面內(nèi)皮細(xì)胞NRP-1受體過表達(dá)同時腫瘤細(xì)胞表面CD13受體過表達(dá)的腫瘤治療。
[0021]本發(fā)明突出的優(yōu)點及特征在于，利用腦膠質(zhì)瘤靶向的內(nèi)源性高載藥RNAi納米給藥系統(tǒng)介導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤的RNAi治療；該給藥系統(tǒng)本身既為載體又為藥物，siRNA遞釋效率能明顯提高，且由于其良好的內(nèi)源性，可成功避免免疫反應(yīng)；iNGR靶向頭基為腫瘤穿透環(huán)肽，能特異性靶向腫瘤新生血管表面，在新生血管表面特定蛋白酶的水解作用下暴露腫瘤穿透末端，進(jìn)一步穿透腫瘤組織到達(dá)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，完成腦膠質(zhì)瘤的RNAi治療；所述的iNGR腫瘤穿透環(huán)肽與普通腫瘤靶向多肽相比較，具有更高的腫瘤細(xì)胞蓄積能力，其介導(dǎo)的RNAi納米給藥系統(tǒng)可實現(xiàn)更加顯著的治療效果；本發(fā)明的自組裝RNAi納米給藥系統(tǒng)具有非常理想的臨床應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0022]圖1腦膠質(zhì)瘤靶向自組裝RNAi納米給藥系統(tǒng)的表征，
[0023]其中，a:pOE1-PEG-LC-1NGR 的氫譜，
[0024]b:pOE1-PEG-LC-1NGR與RNAi NPs以質(zhì)量比10:1復(fù)合所形成納米粒的透射電鏡圖及粒徑分布圖，
[0025]c:凝膠電泳圖顯示pOE1-PEG-LC-1NGR包載RNAi NPs的能力及其谷胱甘肽敏感性。
[0026]圖2納米粒在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs及腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中的攝取，
[0027]其中，a:納米粒在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs中的攝取，
[0028]b:納米粒在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中的攝取。
[0029]圖3納米粒在腦膠質(zhì)瘤模型動物體內(nèi)、腦內(nèi)及瘤內(nèi)的分布，
[0030]其中，a:尾靜脈注射生理鹽水(左)pOE1-PEG/RNAi NPs (中)pOE1-PEG-LC-1NGR/RNAi NPs(右)2h，6h，12h以及24h后活體成像圖，及24h后離體器官成像圖，
[0031]b