一種mek激酶抑制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是屬于一類新結(jié)構(gòu)類型香豆素類化合物，具體地是一種MEK激酶抑制劑。 并主要采用Pechmann等反應(yīng)進(jìn)行了合成；與陽性藥U0126相比，部分化合物表現(xiàn)出良好的 MEK結(jié)合活性、對(duì)非活化MEK的抑制活性，以及抗A375黑色素瘤細(xì)胞和HT-29結(jié)腸癌細(xì) 胞增殖的活性，具有被開發(fā)為抗腫瘤藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路是絲裂原活化蛋白激酶通路（MAPK)中的一個(gè)重要家 族，主要參與細(xì)胞發(fā)育、生長、分化等重要過程，其活性持續(xù)上調(diào)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。 MEK激酶是ERK通路的核心，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，在該通路中起關(guān)鍵的承上啟下 作用。
[0003] 參考對(duì)比發(fā)明專利激酶抑制劑，專利號(hào)為201080049613. 4,其公開了一組新蛋白 激酶抑制劑（吡啶并[4, 3-d]嘧啶-5-酮衍生物）及其藥學(xué)上可接受的鹽，可用于 治療細(xì)胞增殖性疾病或障礙性疾病，如癌癥、自身免疫性疾病、感染、心血管疾病和神 經(jīng)退行性疾病和障礙性疾病。本發(fā)明提供了用于合成蛋白激酶抑制劑化合物的方法及該 化合物的給藥方法。本發(fā)明還提供了包含至少一種該蛋白激酶抑制劑化合物以及適用于該 化合物的藥學(xué)上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑的藥物制劑。本發(fā)明還提供了在吡啶并 [4，3-d]嘧啶-5-酮衍生物的合成過程所產(chǎn)生的有用中間體。
[0004] 就目前所知，只有MEK能激活ERK，ERK也是MEK的唯一底物，這一點(diǎn)是非常特 別的，預(yù)示著MEK抑制劑阻斷ERK通路的作用將是高度特異性的。大部分已報(bào)道的MEK 抑制劑屬于ATP非競(jìng)爭(zhēng)性變構(gòu)抑制劑，其結(jié)構(gòu)大多具有二芳基胺骨架，本文設(shè)計(jì)并合成了 一系列以香豆素為母核的新型ATP非競(jìng)爭(zhēng)性MEK變構(gòu)抑制劑，并對(duì)它們進(jìn)行了活性評(píng)價(jià)，結(jié) 果顯示這類化合物具有良好的MEK結(jié)合活性、MEK抑制活性及抗腫瘤作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種MEK激酶抑制劑，一類新結(jié)構(gòu)類型的香豆素類化合物，并主要 采用Pechmann等反應(yīng)進(jìn)行了合成，同時(shí)對(duì)不同位點(diǎn)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)衍生和修飾?；衔飳?duì)MEK 激酶的抑制作用主要體現(xiàn)在對(duì)非活化MEK磷酸化過程的抑制，而對(duì)磷酸化MEK對(duì)下游底 物ERK磷酸化過程的抑制作用較弱。
[0006] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。
[0007] 本發(fā)明采用香豆素化合物G8935與MEK結(jié)合，用對(duì)接軟件將其與MEK進(jìn)行對(duì) 接，并將結(jié)合模式與二芳基胺類抑制劑Η)318088,并將結(jié)合模式與二芳基胺類抑制劑 Η)318088進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩者打分值相似，G8935與Η)318088的重疊度非常高，而且C3 位芐基占據(jù)新疏水口袋，是香豆素類的新結(jié)合點(diǎn)。因此我們?cè)诖嘶A(chǔ)上設(shè)計(jì)了一系列3位、 4位和7位為不同取代基的香豆素衍生物并進(jìn)行了合成。
[0008] 在一個(gè)方面，本發(fā)明米用以燒?；宜嵋阴樵?，與溴節(jié)或?qū)Ψ骞?jié)在堿性條 件下應(yīng)，制備3-芐基烷酰乙酸乙酯或3-取代芐基烷酰乙酸乙酯，然后與間苯二酚通過 Pechmann應(yīng)制備7-羥基香豆素中間體，最后與酰氯反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物。
[0009] 在一個(gè)方面，本發(fā)明采用HTRF的方法檢測(cè)了化合物與磷酸化MEK1的結(jié)合能 力。米用 384 孔板，加入 Active GST-MEK1，Eu-Anti-GST，Kinase tracer 236 和不同濃 度的待測(cè)化合物，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)信號(hào)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。所測(cè)99個(gè)化合物中，共發(fā)現(xiàn)25 個(gè)化合物具有與磷酸化MEK1結(jié)合能力，IC50值最低達(dá)到54. 57 nM (M29)。
[0010] 在另一方面，本發(fā)明同樣采用HTRF方法檢測(cè)化合物對(duì)磷酸化MEK1的抑制作用， 加入化合物，inactive ERK2，active ΜΕΚΙ,ΑΤΡ，然后加入抗體 MAb Anti-phosphop44/42_K 和MAb Anti GST-XL665,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)信號(hào)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯 示化合物對(duì)磷酸化MEK1的抑制作用的IC50在10 μ Μ左右，因此化合物雖然與磷酸化的 ΜΕΚ1有較強(qiáng)的結(jié)合能力，但是并不能在底物ERK存在的環(huán)境中，影響到磷酸化ΜΕΚ對(duì)ERK 的磷酸化作用。
[0011] 在另一方面，本發(fā)明同樣采用HTRF方法，檢測(cè)化合物對(duì)非磷酸化ΜΕΚ1的抑制作 用。加入化合物，active BRAF，inactive ΜΕΚΙ,ΑΤΡ，然后加入抗體 MAb Anti-phospho MEK1/2-K和MAb Anti GST-XL665,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)信號(hào)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果顯示12、14、15、129、156對(duì)非磷酸化1^1(1的抑制作用較高，活性接近或高于陽 性對(duì)照藥U0126。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 化合物與磷酸化MEK1的結(jié)合活性測(cè)試結(jié)果顯示R1的活性順序?yàn)椋?N(CH3)2C0>MeC0，EtC0>PrC0>N(Et)2C0，其他取代基如 t-BuCO，BuCO，PhCO，Ts， PhS02,0H，0CH3取代時(shí)都無活性。活性最好的化合物是M29，M29與MEK1的對(duì)接結(jié)果。 香豆素環(huán)的羰基與Val211、Ser212主鏈酰胺形成重要?dú)滏I，氨基甲酸酯的羰基與DFG序 列中Asp208主鏈形成氫鍵，而且R2位芐基占據(jù)由Ile216，Phe209，Argl89和Aspl90 形成的疏水口袋?；衔锱c非磷酸化MEK1的抑制作用實(shí)驗(yàn)和化合物抗黑色素瘤細(xì)胞增 殖作用實(shí)驗(yàn)，以及抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示化合物M2、M4、M5、M29、M56的活 性較好，而這些化合物R1均為N，N-二甲基甲酰氧基，說明R1非常重要，N，N-二甲基甲 酰氧基在化合物與MEK作用的過程中產(chǎn)生了至關(guān)重要的影響。這可能與結(jié)構(gòu)中存在氮原 子有關(guān)。因?yàn)榈哂泄聦?duì)電子，可以和溶液中的水分子形成氫鍵，從而增強(qiáng)了化合物在水中 的溶解性。
[0013] 作為新型的非二芳基胺類MEK變構(gòu)抑制劑，這類化合物顯示出良好的MEK抑制 作用及抗腫瘤細(xì)胞增殖作用?；衔颩2、M4、M5、M29、M56在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的MEK 結(jié)合活性、135對(duì)非磷酸化MEK的抑制活性，在體內(nèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出與陽性藥U0126 相當(dāng)甚至更高的抗A375黑色素瘤細(xì)胞和HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的活性，因此有可能成為 非常有潛力的抗腫瘤藥，用于腫瘤疾病的治療，有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。化合物對(duì)MEK的抑制 作用主要體現(xiàn)在對(duì)非磷酸化MEK磷酸化過程的抑制，而對(duì)磷酸化MEK對(duì)下游底物ERK磷 酸化過程的抑制作用較弱。進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化及藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)研究、作用機(jī)制方面的研究 工作正在進(jìn)行。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種MEK激酶抑制劑，其特征在于，香豆素化合物G8935與MEK結(jié)合，用對(duì)接軟件將 其與MEK進(jìn)行對(duì)接，并將結(jié)合模式與二芳基胺類抑制劑Η)318088,并將結(jié)合模式與二芳基 胺類抑制劑Η)318088進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩者打分值相似，G8935與Η)318088的重疊度非 常高，而且C3位芐基占據(jù)新疏水口袋，是香豆素類的新結(jié)合點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一系列3 位、4位和7位為不同取代基的香豆素衍生物并進(jìn)行了合成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種MEK激酶抑制劑，其特征在于，本發(fā)明采用以烷酰基乙酸 乙酯為原料，與溴芐或?qū)Ψ迤S在堿性條件下應(yīng)，制備3-芐基烷酰乙酸乙酯或3-取代芐 基烷酰乙酸乙酯，然后與間苯二酚通過Pechmann應(yīng)制備7-羥基香豆素中間體，最后與酰氯 反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種MEK激酶抑制劑，其特征在于，本發(fā)明采用HTRF的 方法檢測(cè)了化合物與磷酸化MEK1的結(jié)合能力，采用384孔板，加入Active GST-MEK1， Eu-Anti-GST，Kinase tracer 236和不同濃度的待測(cè)化合物，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)信號(hào)并對(duì)數(shù) 據(jù)進(jìn)行處理；所測(cè)99個(gè)化合物中，共發(fā)現(xiàn)25個(gè)化合物具有與磷酸化MEK1結(jié)合能力，IC50 值最低達(dá)到54. 57 nM (M29)。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種MEK激酶抑制劑，其特征在于，本發(fā)明同樣采用HTRF方 法檢測(cè)化合物對(duì)磷酸化MEK1的抑制作用，加入化合物inactiveERK2,activeMEK1，ATP， 然后加入抗體MAbAnti-phosphop44/42-K和MAbAntiGST-XL665,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)信 號(hào)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次結(jié)果顯示化合物對(duì)磷酸化MEK1的抑制作用的IC50在 10μΜ左右，因此化合物雖然與磷酸化的MEK1有較強(qiáng)的結(jié)合能力，但是并不能在底物ERK 存在的環(huán)境中，影響到磷酸化ΜΕΚ對(duì)ERK的磷酸化作用。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種ΜΕΚ激酶抑制劑，其特征在于，本發(fā)明同樣采用HTRF方 法，檢測(cè)化合物對(duì)非磷酸化MEK1的抑制作用；加入化合物，activeBRAF，inactiveMEK1， ATP，然后加入抗體MAbAnti-phosphoMEK1/2-K和MAbAntiGST-XL665,采用酶標(biāo)儀檢 測(cè)信號(hào)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次結(jié)果顯示12、14、15、129、156對(duì)非磷酸化1^1(1的 抑制作用較高，活性接近或高于陽性對(duì)照U0126。
【專利摘要】本發(fā)明一種MEK激酶抑制劑，其是一種具有功能類全的香豆素類化合物，并主要采用Pechmann等反應(yīng)進(jìn)行了合成；與陽性藥U0126相比，部分化合物表現(xiàn)出良好的MEK結(jié)合活性、對(duì)非活化MEK的抑制活性，以及抗A375黑色素瘤細(xì)胞和HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的活性，具有被開發(fā)為抗腫瘤藥物；化合物對(duì)MEK激酶的抑制作用主要體現(xiàn)在對(duì)非活化MEK磷酸化過程的抑制，而對(duì)磷酸化MEK對(duì)下游底物ERK磷酸化過程的抑制作用較弱。
【IPC分類】C07D311/16, A61K31/37, A61P35/00
【公開號(hào)】CN105287509
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410377809
【發(fā)明人】陶建臣
【申請(qǐng)人】陶建臣
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2014年8月1日