治療缺氧誘導因子(hif)相關的狀況的方法
【專利說明】治療缺氧誘導因子（HIF)相關的狀況的方法
[0001] 描沭 發(fā)明領域
[0002] 本發(fā)明涉及治療缺氧誘導因子（HIF)相關的狀況的方法，且特別地涉及治療HIF 相關的狀況的方法，所述方法包括施用包含轉鐵蛋白的組合物。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 保護細胞且特別是神經(jīng)元免受由包括以下的各種因素引起的損害：中風、神經(jīng)退 行性疾病、外傷性損傷等等，對細胞或神經(jīng)元功能的長期恢復是重要的。通過單一的劑對損 傷的細胞或神經(jīng)元的療治處理具有優(yōu)勢，但常常不足以調動有助于恢復完全功能所需要的 分子的復雜性。
[0005] 保護神經(jīng)元或其他細胞免受缺氧或缺血性事件、或氧化的生理反應，常常被認為 是由通過缺氧誘導因子（HIF)信號傳導通路上調的基因的表達來介導，所述缺氧誘導因子 (HIF)信號傳導通路是響應細胞損害的關鍵調控通路。在腦中，神經(jīng)保護分子的上調被認為 是保護細胞免受不可挽回的損害的關鍵因素。然而，幾乎沒有可用藥物足以能夠阻止、恢復 或降低對神經(jīng)元和其他組織的損害。此外，它們常常是有毒的，具有短的半衰期，或兩者兼 而有之。例如，國際專利申請W02006/20727提出了去鐵胺作為針對再灌注的有害效應的神 經(jīng)保護（neuroprotector)劑的用途；然而，由于其在血衆(zhòng)中降低的半衰期，去鐵胺的施用 構成問題。
[0006] 轉鐵蛋白是控制生物體液中的游離鐵的水平的鐵結合血液血漿糖蛋白。轉鐵 蛋白在循環(huán)中發(fā)揮了鐵的主要轉運蛋白的作用，其中轉鐵蛋白以不含鐵的脫鐵轉鐵蛋 白（apo_transferrin，ApoTf)形式，作為單鐵的（monoferric)轉鐵蛋白、或作為二鐵 的（diferric)飽和鐵轉鐵蛋白（holo-transferrin，HoloTf)存在。通常，鐵結合循環(huán) 中全部轉鐵蛋白結合位點的30%。Chen-Roetling等人已公開了 ApoTf而非HoloTf的 神經(jīng)保護功能（Chen-Roetling J·，Chen L·，和 Regan R.F. Neuropharmacology，2011; 60(2-3) :423-431.)，表明ApoTf可在腦內出血后減輕血紅蛋白的神經(jīng)毒性。
[0007] 本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過將轉鐵蛋白與其他鐵螯合劑或與另一種鐵結合血 漿蛋白諸如脫鐵乳鐵蛋白（Apolactoferrin)組合，提高轉鐵蛋白施用在患者中的神經(jīng)保 護特性是可能的，所述脫鐵乳鐵蛋白已顯示增加了一些組織中的HIF-?α蛋白水平并對血 漿 ΕΡ0 水平有影響（Zakharova E.T.等人 Biometals (2012) 25:1247-1259)。已表明具有鐵 螯合能力的分子是通過阻斷脯氨酰羥化酶的活性的HIF通路活化劑。
[0008] 因此，本發(fā)明涉及治療缺氧誘導因子（HIF)相關的狀況的方法，所述方法包括施 用包含轉鐵蛋白的組合物。本發(fā)明還涉及治療缺氧誘導因子（HIF)相關的狀況的方法，其 中施用的組合物還包含轉鐵蛋白和鐵螯合劑的組合。
[0009] 如本文所用的，術語"轉鐵蛋白"及其復數(shù)是指單獨ApoTf、或單獨HoloTf或其混 合物。
[0010] 附圖簡述
[0011] 參考以下附圖進一步描述本發(fā)明，其中：
[0012] 圖 1 不出了多數(shù)ApoTf (majority ApoTf)和多數(shù)HoloTf (majority HoloTf)的組 合物在常氧和低氧條件下處理6小時后誘導HIF-1 α蛋白。
[0013] 圖2示出了多數(shù)ApoTf和多數(shù)HoloTf的組合物在常氧條件下處理24小時后誘導 HIF-la 蛋白。
[0014] 圖3示出了 ApoTf和HoloTf的混合物處理后6小時誘導HIF-1 a蛋白。
[0015] 圖4A示出了在常氧和低氧條件下在HSA、脫鐵轉鐵蛋白或飽和鐵轉鐵蛋白的存在 下Glutl的mRNA表達水平。
[0016] 圖4B示出了在常氧和低氧條件下在HSA、脫鐵轉鐵蛋白或飽和鐵轉鐵蛋白的存在 下VEGF的mRNA表達水平。
[0017] 圖5A示出了包含多數(shù)HoloTf或多數(shù)ApoTf的組合物的體外（in vitro)或體內 (in vivo)毒性。
[0018] 圖5B示出了用包含多數(shù)ApoTf或HoloTf的藥物靜脈注射處理的大鼠的改良的 Bederson和一般行為評分。
[0019] 圖6A示出了短暫性大腦中動脈閉塞（MCAo)大鼠模型中ApoTf (385mg/kg，IV)或 鹽水處理的梗塞體積的散點圖。
[0020] 圖6B示出了來自代表性對照和ApoTf處理的大鼠的氯化三苯基四氮唑（TTC)染 色的冠狀縫切面。
[0021] 圖7示出了主要包含ApoTf和HoloTf的混合物保護神經(jīng)元細胞免受Abeta (1-42) 的毒性效應。
[0022] 圖8A示出了用4mg/ml多數(shù)ApoTf及用多數(shù)ApoTf和DF0或10X2的組合處理 SH-SY5Y神經(jīng)元細胞。
[0023] 圖8B示出了用4mg/ml所示蛋白及用所示蛋白和10uM M30的組合處理SH-SY5Y 神經(jīng)元細胞。
[0024] 圖8C示出了用4mg/ml所示蛋白及用所示蛋白和200uM DF0的組合處理SH-SY5Y 神經(jīng)元細胞。
[0025] 圖9A不出了 Glutl響應多數(shù)脫鐵轉鐵蛋白（majority Apotransferrin)與DF0 或10X2組合的mRNA表達水平。
[0026] 圖9B示出了 VEGF響應多數(shù)脫鐵轉鐵蛋白與DF0或10X2組合的mRNA表達水平。
[0027] 圖10A示出了在正常氧氣水平下用4mg/mL多數(shù)脫鐵轉鐵蛋白、多數(shù)飽和鐵轉鐵 蛋白（majority Holo-transferrin)或每一種的多種混合物處理原代人腎近端小管上皮 (RPTEC)細胞6小時后的HIF-1 α水平。
[0028] 圖10Β示出了在正常氧氣水平下用4mg/mL多數(shù)脫鐵轉鐵蛋白、多數(shù)飽和鐵轉鐵蛋 白或每個的多種混合物處理原代皮質上皮（HRCE)細胞6小時后的HIF-la水平。
[0029] 圖11A示出了當用多數(shù)ApoTf或DF0處理48小時時，原代人腎近端小管上皮 (RPTEC)或皮質上皮（HRCE)細胞的存活力（viability)。
[0030] 圖11B示出了當用4mg/mL多數(shù)ApoTf、多數(shù)HoloTf、轉鐵蛋白的混合物處理72小 時時，RPTEC或HRCE細胞的存活力。
[0031] 圖12示出了在多數(shù)ApoTf或DF0的存在下人原代腎細胞內的半胱天冬酶3/7活 化。
[0032] 圖13A示出了在正常氧氣水平下用4mg/mL多數(shù)脫鐵轉鐵蛋白、多數(shù)飽和鐵轉鐵蛋 白或pd-轉鐵蛋白（pd-Transferrin)處理肺細胞系NCI-H16506小時后的HIF-la水平。
[0033] 圖13B示出了在正常氧氣水平下用4mg/mL多數(shù)脫鐵轉鐵蛋白、多數(shù)飽和鐵轉鐵蛋 白或pd-轉鐵蛋白處理原代肝細胞6小時后的HIF-1 a水平。
[0034] 圖14A示出了當用4mg/mL的多數(shù)ApoTf、多數(shù)HoloTf、或pd-轉鐵蛋白處理72小 時時，人肺細胞系NCI-H1650的存活力。
[0035] 圖14B示出了當用4mg/mL的多數(shù)ApoTf、多數(shù)HoloTf、或pd-轉鐵蛋白處理72小 時時，原代人肝細胞的存活力。
【具體實施方式】
[0036] 在一方面，本發(fā)明涉及治療缺氧誘導因子（HIF)相關的狀況的方法，所述方法包 括施用包含轉鐵蛋白的組合物。優(yōu)選地，轉鐵蛋白是重組體、源自血衆(zhòng)的（plasmaderived) 或化學合成的轉鐵蛋白。
[0037] 當轉鐵蛋白是重組體時，其可根據(jù)蛋白表達、產(chǎn)生和純化的領域中已知的任何 技術來獲得。例如，可將轉鐵蛋白的核酸序列插入適合于在選擇的宿主細胞中表達的 任何載體，所述選擇的宿主細胞，例如細菌（大腸桿菌（Escherichia coli)、枯草芽孢 桿菌（Bacilus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、鏈霉菌屬（Streptomyces)和葡萄球菌屬（Staphylococcus))、酵母（酵母 菌屬（Saccharomyces)、畢赤酵母屬（Pichia)或克魯維酵母屬（Kuyveromyces genus))、昆 蟲細胞（家香（Bombyx mori)、甘藍夜蛾（Mamestra brassicae)、草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾（Trichoplusia ni)或黑腹果繩（Drosophila melanogaster))或 哺乳動物細胞（HeLa細胞、幼倉鼠腎（BHK)細胞、猴腎細胞（C0S