活疫苗耐熱保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及活疫苗耐熱保護(hù)劑，本發(fā)明還涉及所述耐熱保護(hù)劑的制備方法和應(yīng) 用，屬于活疫苗耐熱保護(hù)劑的制備及應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞傳染性支氣管炎（IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV)引起的一種急性高度 接觸性傳染病，表現(xiàn)為咳嗽、噴嚏、氣管羅音等癥狀。雞傳染性支氣管炎給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái) 了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 中國(guó)在耐熱凍干保護(hù)劑方面的研究起步較晚，但在這方面的研究已取得了一定的 成果，現(xiàn)有的耐熱凍干保護(hù)劑物質(zhì)組份通常為：明膠、牛血清白蛋白、蔗糖、PVPK30、山梨醇、 谷氨酸鈉、Vc，使用時(shí)需將高分子化合物經(jīng)高壓滅菌、低分子化合物經(jīng)0. 22um濾器過(guò)濾后， 按1 :1比例加入病毒抗原液中，分裝后進(jìn)行冷凍干燥。凍干的疫苗在2-8°C條件下，保存24 個(gè)月以后，病毒滴度無(wú)明顯下降，37°C放置10天，EID5。下降約0. 8個(gè)滴度，全程凍干需要48 個(gè)小時(shí)左右；存在配方和配制過(guò)程復(fù)雜，凍干時(shí)間長(zhǎng)，而且耐熱后病毒含量下降多等缺點(diǎn)。
[0004] 因此，改良現(xiàn)有保護(hù)劑的配方及凍干曲線，解決現(xiàn)有耐熱保護(hù)劑配制程序復(fù)雜、凍 干時(shí)間長(zhǎng)、耐熱后疫苗滴度下降多、成本高等問(wèn)題，將具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種活疫苗耐熱保護(hù)劑，應(yīng)用所述耐熱保護(hù)劑 制備的雞傳染性支氣管炎活疫苗，耐熱后疫苗滴度下降少，疫苗的效力更加穩(wěn)定，且凍干時(shí) 間短，耗費(fèi)成本低；
[0006] 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種所述活疫苗耐熱保護(hù)劑的制備方 法，其配制過(guò)程簡(jiǎn)單；
[0007] 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供所述活疫苗耐熱保護(hù)劑在制備雞傳染 性支氣管炎活疫苗中的應(yīng)用。
[0008] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0009] 本發(fā)明首先公開(kāi)了一種活疫苗耐熱保護(hù)劑，包括以下各組分：海藻糖、葡萄糖、明 膠、硫脲、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVPK30)和純水。
[0010] 每100ml活疫苗耐熱保護(hù)劑中，各組分的含量為：海藻糖l_5g，葡萄糖5-10g，明膠 0. 5-2g，硫脲l-6g，聚乙烯吡咯烷酮K30 2-6g，余量為純水；
[0011] 優(yōu)選的，每l〇〇ml活疫苗耐熱保護(hù)劑中，各組分的含量為：海藻糖2-5g，葡萄糖 5-10g，明膠0. 5-2g，硫脲l-6g，聚乙烯吡咯烷酮K30 4-6g，余量為純水；
[0012] 更優(yōu)選的，每l〇〇ml活疫苗耐熱保護(hù)劑中，各組分的含量為：海藻糖5g，葡萄糖 5-10g，明膠0. 5-2g，硫脲lg，聚乙烯吡咯烷酮K30 6g，余量為純水；
[0013] 最優(yōu)選的，每l〇〇ml活疫苗耐熱保護(hù)劑中，各組分的含量為：海藻糖5g，葡萄糖5g， 明膠2g，硫脲lg，聚乙烯吡咯烷酮K30 6g，余量為純水。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種所述活疫苗耐熱保護(hù)劑的制備方法，包括：按照所述比 例稱取各組分，混合均勻，高壓滅菌，即得。其中，所述高壓滅菌為121°c滅菌15分鐘。
[0015] 本發(fā)明選擇配方組份中的主要成份海藻糖、硫脲和PVPK30,通過(guò)正交試驗(yàn)方法配 制9組保護(hù)劑，制備凍干雞傳染性支氣管炎活疫苗并進(jìn)行性狀檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn) 等，進(jìn)行初步篩選。結(jié)果表明，按照g/ml計(jì)，每100ml活疫苗耐熱保護(hù)劑中，海藻糖5%、硫 脲1%和PVPK30 6%的配方，疫苗37°C保存10天，病毒滴度下降的最少，約0.8個(gè)滴度。
[0016] 本發(fā)明所述的活疫苗耐熱保護(hù)劑能夠應(yīng)用于制備活疫苗；其中，所述的活疫苗是 雞傳染性支氣管炎活疫苗。
[0017] 本發(fā)明還公開(kāi)了一種添加了本發(fā)明耐熱保護(hù)劑的雞傳染性支氣管炎活疫苗制備 方法，包括以下步驟：將雞傳染性支氣管炎活病毒液與所述的活疫苗耐熱保護(hù)劑混合均勻， 冷凍干燥，即得。
[0018] 其中，所述冷凍干燥的方式包括：_30°C預(yù)凍3小時(shí)，一期升華-30°C~-15°C，28 小時(shí)，二期干燥-15°C~28°C，17小時(shí)；全程48小時(shí)；
[0019] 或者，-40°C預(yù)凍4小時(shí)，一期升華-40°C~-15°C，18小時(shí)，二期干燥-15°C~ 28°C，14小時(shí)；全程36小時(shí)；
[0020] 或者，-40°C預(yù)凍4小時(shí)，一期升華-40°C~-15°C，14小時(shí)，二期干燥-15°C~ 22°C，6小時(shí)；全程24小時(shí)。
[0021] 雞傳染性支氣管炎活病毒液與所述活疫苗耐熱保護(hù)劑按照體積比1 :0. 5-2混合， 優(yōu)選為按照體積比1 :1混合；更優(yōu)選的，其中所述雞傳染性支氣管炎活病毒液是雞傳染性 支氣管炎病毒H120株或H52株的活病毒液。可以采用SPF雞胚培養(yǎng)以增殖雞傳染性支氣 管炎病毒收獲活病毒液，其具體方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0022] 本發(fā)明根據(jù)所用凍干機(jī)器的性能特點(diǎn)、所用的保護(hù)劑的種類及凍干病毒的生物學(xué) 特性及生化指標(biāo)等因素，設(shè)定3組凍干曲線，以優(yōu)化出最佳的適宜生產(chǎn)的凍干曲線。結(jié)果 表明，3組凍干曲線中，產(chǎn)品-40 °C預(yù)凍4小時(shí)，一期升華-40 °C~-15 °C，14小時(shí)，二期干 燥-15°C~22°C，6小時(shí)；全程24小時(shí)的凍干曲線制備的疫苗，37°C耐熱后病毒滴度下降的 最少，僅〇. 48。
[0023] 本發(fā)明還公開(kāi)了所制備得到的雞傳染性支氣管炎活疫苗。本發(fā)明所制備的雞傳染 性支氣管炎活疫苗37°C耐熱后病毒含量下降少，約0. 4個(gè)滴度，疫苗的效力更加穩(wěn)定。
[0024] 為了驗(yàn)證本發(fā)明活疫苗制備方法的生產(chǎn)性能，分別利用現(xiàn)有技術(shù)的舊方法和本發(fā) 明方法各制備10批疫苗，對(duì)凍干曲線全程時(shí)間、疫苗2-8°C保存期、疫苗37°C保存10天病 毒含量的下降進(jìn)行比較。結(jié)果表明，舊方法不僅配方復(fù)雜，不易于大規(guī)模生產(chǎn)，而且其凍干 時(shí)間為48個(gè)小時(shí)，疫苗耐熱后病毒含量下降約0. 8個(gè)滴度。而本發(fā)明方法耐熱保護(hù)劑的配 方簡(jiǎn)單，且只需高壓滅菌，配制過(guò)程簡(jiǎn)單，適宜大規(guī)模生產(chǎn)；其凍干時(shí)間為24小時(shí)，耐熱后 病毒含量下降約〇. 4個(gè)滴度，疫苗在2-8 °C條件下可以保存36個(gè)月。綜上，本發(fā)明耐熱保護(hù) 劑及使用本保護(hù)劑的雞傳染性支氣管炎活疫苗的制備可應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0025] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
[0026] 本發(fā)明活疫苗耐熱保護(hù)劑的配方及配制程序簡(jiǎn)單，僅采用一次性高壓滅菌，成本 低；同時(shí)，本發(fā)明對(duì)雞傳染性支氣管炎活疫苗制備中的凍干曲線進(jìn)行優(yōu)化，使凍干時(shí)間由 48小時(shí)縮短至24小時(shí)且耐熱后疫苗滴度下降少，疫苗的效力更加穩(wěn)定，安全性好。
[0027] 本發(fā)明所涉及到的術(shù)語(yǔ)宙義
[0028] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0029] 可互換使用的術(shù)語(yǔ)"疫苗"或"疫苗組合物"指這樣的藥物組合物，其包括在動(dòng)物 中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的至少一種免疫原性組合物。疫苗或疫苗組合物可以保護(hù)動(dòng)物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增強(qiáng)活性組分的免疫活性的一種或多種另 外組分。疫苗或疫苗組合物可以另外包括對(duì)于疫苗或疫苗組合物典型的進(jìn)一步組分，包括 例如佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑。疫苗的免疫活性組分可以包括以其原始形式的完全活生物體或在 經(jīng)修飾的活疫苗中作為經(jīng)減毒的生物體，或在經(jīng)殺死或滅活的疫苗中通過(guò)合適方法滅活的 生物體，或包括病毒的一種或多種免疫原性組分的亞單位疫苗，或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的方法制備的遺傳改造、突變或克隆的疫苗。疫苗或疫苗組合物可以包括一種或同時(shí)超 過(guò)一種上述組分。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0031] 1、材料和試劑
[0032] 材料：11日齡SPF雞胚由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)一部提供。
[0033] 毒株：H120株、H52株購(gòu)買自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0034] 試劑：海藻糖購(gòu)買自南寧中諾有限公司、葡萄糖購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公 司、明膠購(gòu)買自AMRESC0公司、硫脲購(gòu)買自AMRESC0公司、PVPK30購(gòu)買自日本化工試劑公司。
[0035] 實(shí)施例1耐熱保護(hù)劑的制備
[0036] 按照以下比例稱取各組分：
[0037] 海藻糖：5g ;
[0038] 葡萄糖：5g ;
[0039] 明膠：0· 5g ;
[0040] 硫脲：lg;
[0041] PVPK30 ：6g ；
[0042] 加純水至100ml。
[0043] 將上述溶液混合均勻，121°C滅菌15分鐘，即得。
[0044] 實(shí)施例2耐熱保護(hù)劑的制備
[0045] 按照以下比例稱取各組分：
[0046] 海藻糖：5g ;
[0047] 葡萄糖：10g;
[0048] 明膠：2g ;
[0049] 硫脲：6g ;
[0050] PVPK30 ：6g ；
[0051] 加純水至100ml。
[0052] 將上述溶液混合均勻，121°C滅菌15分鐘，即得。
[0053] 實(shí)施例3耐熱保護(hù)劑的制備
[0054] 按照以下比例稱取各組分：
[0055] 海藻糖：5g ;
[0056] 葡萄糖：10g;
[0057] 明膠：2g ;
[0058] 硫脲：lg;
[0059] PVPK30 ：6g ；
[0060] 加純水至100ml。
[0061] 將上述溶液混合均勻，121°C滅菌15分鐘，即得。
[0062] 實(shí)施例4耐熱保護(hù)劑的制備
[0063] 按照以下比例稱取各組分：
[0064] 海藻糖：5g ;
[0065] 葡萄糖：5g ;
[0066] 明膠：2g ;
[0067] 硫脲：lg;
[0068] PVPK30 ：6g ；
[0069] 加純水至100ml。
[0070] 將上述溶液混合均勻，121°C滅菌15分鐘，即得。 [0071 ] 實(shí)施例5耐熱保護(hù)劑的制備
[0072] 按照以下比例稱取各組分：
[0073] 海藻糖：lg;
[0074] 葡萄糖：5g ;
[0075] 明膠：0· 5g ;
[0076] 硫脲：lg;
[0077] PVPK30 ：2g ；
[0078] 加純水至100ml。
[0079] 將上述溶液混合均勻，121°C滅菌15分鐘，即得。
[0080] 實(shí)施例6耐熱保護(hù)劑的制備
[0081] 按照以下比例稱取各組分：
[0082] 海藻糖：2g ;
[0083] 葡萄糖：5g ;
[0084] 明膠：0· 5g ;
[0085] 硫脲：lg;
[0086] PVPK30 ：4g ；
[0087] 加純水至100ml。
[0088] 將上述溶液混合均勻，121°C滅菌15分鐘，即得。
[0089] 實(shí)施例7耐熱保護(hù)劑的制備
[0090] 按照以下比例稱取各組分：
[0091] 海藻糖：3g;
[0092] 葡萄糖：6g ;
[0093] 明膠：lg;
[0094] 硫脲：2g ;
[0095] PVPK30 ：5g ；
[0096] 加純水至100ml。
[0097] 將上述溶液混合均勻，121°C滅菌15分鐘，