功能化白蛋白及其納米制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種功能化白蛋白及其納米制劑的制備方法，屬于納米藥物及傳遞載體技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞長期接觸某一化療物后可產(chǎn)生對此種化療藥物耐藥性，而且可對其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。阿霉素(Doxorubicin)是乳腺癌化療的常用藥物，乳腺癌細(xì)胞對阿霉素產(chǎn)生耐藥是阿霉素化療失敗的主要原因(Detwiler A, et al.，2013)，也是影響臨床腫瘤患者預(yù)后的重要因素?，F(xiàn)今逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞耐藥性的方法較少，目前研究發(fā)現(xiàn)MDR的有效抑制劑有維拉帕米、環(huán)孢素A、三苯氧胺、類固醇激素(Goncalves RS, et al., 2012; Zhang,et al.，2013; Zhang LH, et al.，2005)等，但這些耐藥逆轉(zhuǎn)劑干擾傳統(tǒng)的抗癌藥物藥代動(dòng)力學(xué)，且可引起嚴(yán)重的毒副作用等，至今都未取得預(yù)期的臨床效果，因此在臨床上被限制使用。
[0003]近年來納米藥物用于逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性受到越來越多的重視，脂質(zhì)體、高分子聚合物納米載體、膠束等納米制劑(X1ngXB, et al., 2005 ；Ling Peng, et al., 2015)已被用于逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的研究。其逆轉(zhuǎn)原理為納米制劑通過內(nèi)吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，通過響應(yīng)性釋放等性質(zhì)將藥物釋放在胞質(zhì)中，在很大程度上避開p-gp栗對游離抗腫瘤藥物的外排作用，增加藥物的攝取量，進(jìn)而增強(qiáng)抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果。
[0004]pH響應(yīng)性的藥物釋放系統(tǒng)是一類智能藥物釋放系統(tǒng)，它能根據(jù)所處環(huán)境的酸堿度對藥物進(jìn)行可控性的釋放。人體的腫瘤胞外環(huán)境(pH 5.7-7.8)比正常血液或組織(pH約
7.4)顯酸性，而且細(xì)胞內(nèi)涵體和溶酶體的pH更分別低至5.0和4.5。該類新型納米載體可通過胞吞途徑攜載藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)涵體，避免了 P-gp對藥物的識(shí)別，而后內(nèi)涵體的酸化(pH的改變)使其發(fā)生解聚或溶解，造成膜內(nèi)外滲透壓的變化，使內(nèi)涵體快速地膨脹破裂，從而集中釋放藥物至胞漿，完成對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。因此，pH響應(yīng)性的藥物釋放系統(tǒng)在生物醫(yī)藥等領(lǐng)域尤其是抗腫瘤領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0005]本發(fā)明中使用內(nèi)源性分子白蛋白及配位基團(tuán)修飾(如組胺二鹽酸鹽等)，通過化學(xué)反應(yīng)合成功能化白蛋白，不僅能夠改變白蛋白的等電點(diǎn)至堿性，可使其在中性環(huán)境下形成較好的納米顆粒；同時(shí)接枝的組胺能夠提供咪唑基團(tuán)，提高了載體的緩沖能力，重點(diǎn)是增加了能夠與金屬離子配位的基團(tuán)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]目的:為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種功能化白蛋白，通過pH響應(yīng)性金屬配位鍵包載藥物，無需有機(jī)溶劑及高壓均質(zhì)技術(shù)等方式實(shí)現(xiàn)納米顆粒的制備，可以在水溶液中自組裝形成納米顆粒，材料的合成簡單易行、納米顆粒的制備綠色環(huán)保。
[0007]技術(shù)方案:為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為: 一種功能化白蛋白，其特征在于:所述功能化白蛋白是通過化學(xué)反應(yīng)將配位基團(tuán)修飾到白蛋白游離基團(tuán)上，使具有與金屬離子配位的功能。
[0008]所用白蛋白，選自牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、重組人血清白蛋白、卵清蛋白、卵白蛋白、血清白蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麥白蛋白、豆白蛋白；所修飾的配位基團(tuán)選自胺基、咪唑基、胍基、羥基、巰基、羧基、磺酸基、磷酸基。
[0009]本發(fā)明還提供一種功能化白蛋白納米制劑，由上述的功能化白蛋白、金屬離子、藥物組成；金屬離子同時(shí)與功能化白蛋白和藥物形成配位鍵，誘導(dǎo)自組裝形成納米顆粒。功能化白蛋白納米制劑是將功能化白蛋白、金屬離子和藥物通過配位誘導(dǎo)的組裝方式而形成的。
[0010]所述的功能化白蛋白納米制劑的制備方法，包括以下步驟:
(1)首先將藥物與金屬鹽按照配位比例為1:0.5-1:4進(jìn)行混合，得藥物與金屬離子的配位復(fù)合物；
(2)在攪拌條件下，將藥物與金屬的配位復(fù)合物逐滴加入到1-5%(W/V)的功能化白蛋白水溶液中；
(3)使用0.1 M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-8.0，然后在0?50°C下攪拌0.5_12h ；
(4)使用截留分子量為3500-14000的透析袋在水中透析除去游離藥物后，冷凍干燥即得。可用水復(fù)溶后使用；用于靶向輸送藥物。
[0011]所述的功能化白蛋白納米制劑的制備方法，其特征在于:所述的金屬鹽為可溶性的鋅鹽、鐵鹽、銅鹽、鈷鹽、錳鹽、鎳鹽、鑭鹽、釓鹽、銀鹽、鋯鹽、鈦鹽；選自硝酸鋅，硝酸鐵，硝酸銅，硝酸鈷，硝酸錳，硝酸鎳，硝酸鑭，硝酸釓，硝酸銀，硝酸鋯，硝酸鈦，氯化鋅，氯化鐵，氯化銅，氯化鈷，氯化錳，氯化鎳，氯化鋯，氯化鑭，氯化釓，氯化銀，氯化鋯，氯化鈦，硫酸鋅、硫酸鐵、硫酸銅、硫酸鈷、硫酸錳、硫酸鎳、硫酸鑭，硫酸釓，硫酸銀，硫酸鋯，硫酸鈦中的一種或幾種。
[0012]所述的功能化白蛋白納米制劑的制備方法，其特征在于:所述藥物為含有羥基、羰基、巰基、氨基、羧基、胍基、磺酸基或磷酸基的有機(jī)化合物。
[0013]作為更優(yōu)選，所述藥物為蒽環(huán)類藥物或黃酮類藥物。
[0014]作為優(yōu)選方案，所述蒽環(huán)類藥物包括鹽酸柔紅霉素、鹽酸阿霉素、鹽酸伊達(dá)比星、鹽酸表阿霉素、鹽酸阿柔比星、鹽酸佐柔比星、吡柔比星、依索比星、卡柔比星、奈莫柔比星、戊柔比星、地托比星、羅多比星、美多比星、達(dá)佐霉素、絲裂霉素、博萊霉素、平陽霉素、米托蒽醌、茜素紅、鄰菲啰啉。
[0015]作為優(yōu)選方案，所述黃酮類藥物包括大黃素、黃芩素、黃芩苷、槲皮素、蘆丁、陳皮素、甘草苷、水飛薊素、兒茶素、銀杏素、木犀草苷、木犀草素、葛根黃酮。
[0016]有益效果:本發(fā)明提供的功能化白蛋白與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
該材料的合成方法簡單，使用內(nèi)源性分子白蛋白及含有配位基團(tuán)的分子(如組胺二鹽酸鹽等)，通過化學(xué)反應(yīng)合成功能化白蛋白，不僅能夠改變白蛋白的等電點(diǎn)至堿性，可使其在中性環(huán)境下形成較好的納米顆粒；同時(shí)接枝的組胺能夠提供配位基團(tuán)，提高了載體的緩沖能力，重點(diǎn)是增加了能夠與金屬離子配位的基團(tuán)。該功能化白蛋白納米制劑的制備方法簡單易行，不使用有機(jī)溶劑，可使其在中性環(huán)境下在水溶液中形成較好的納米顆粒，即將藥物及功能化白蛋白通過金屬配位鍵交聯(lián)起來，并通過調(diào)節(jié)pH值至中性使其組裝成納米顆粒。本發(fā)明的自組裝納米顆粒能夠通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，避開p-gp栗對藥物的外排作用，并根據(jù)PH的細(xì)微變化進(jìn)行可控的藥物釋放，實(shí)現(xiàn)對耐藥腫瘤細(xì)胞的有效治療。
【附圖說明】
[0017]圖1為實(shí)施例1中功能化白蛋白合成示意圖。
[0018]圖2為實(shí)施例4中合成的功能化白蛋白的表征:(A)元素分析，(B)SDS-PAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，(C)緩沖能力試驗(yàn)。
[0019]圖3為實(shí)施例8中制備的納米顆粒的表征:(A)熒光猝滅法證明BH與Fe3+可以配位，(B)、(C)分別為 ICP-MS 測定 D0X- Fe3+配合物中的 Fe 和 N，(D) D0X、BH_ Fe 3+、D0X_Fe3+及BH- Fe 3+_D0X納米顆粒(NPs)的紫外吸收光譜，(E)BH- Fe3+-D0X納米顆粒溶解在pH值為7.4、6.5、5.5、4.5的PBS及1M HC1中的紫外吸收光譜。
[0020]圖4為實(shí)施例9中制備的納米顆粒的響應(yīng)性釋放:(A) BH- Fe3+_D0X納米顆粒在pH值為7.4、6.5、5.5、4.5的PBS中的累積釋放曲線，(B)BH_ Fe3+_D0X納米顆粒在pH 7.4的PBS及ImM的去鐵胺(DF0)中的累積釋放曲線。
[0021]圖5為實(shí)施例10中制備的納米顆粒在敏感及耐藥乳腺癌細(xì)胞中不同藥物濃度下不同時(shí)間的細(xì)胞毒性:(A) MCF-7，24h、(B) MCF-7/ADR，24h (C) MCF-7，72h、(D) MCF-7/ADR，72h0
[0022]圖6為實(shí)施例10中制備的納米顆粒在敏感及耐藥乳腺癌細(xì)胞中的攝取研究:(A)在MCF-7、(B) MCF-7/ADR細(xì)胞上，對照相當(dāng)量的游離藥，給予不同濃度的納米顆粒，觀察不同時(shí)間段內(nèi)的攝取量，(C)在MCF-7、MCF-7/ADR細(xì)胞中分別給予相當(dāng)量藥物濃度的游離藥及納米顆粒，孵育一定時(shí)間后對溶酶體及細(xì)胞核進(jìn)行染色，共聚焦顯微鏡下觀察攝取情況。
[0023]圖7為實(shí)施例10中制備的納米顆粒對耐藥乳腺癌細(xì)胞株的細(xì)胞凋亡效果。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。
[0025]實(shí)施例1
如圖1所示，在攪拌條件下，將13.875g組胺二鹽酸鹽(HA)加入到50ml 50%(W/V)牛血清白蛋白(BSA)的中性磷酸鹽緩沖溶液中，然后使用1M HC1溶液調(diào)節(jié)體系的pH值到4.75，最后加入4.5g 1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.Η(:1)進(jìn)行催化，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6h。加入4M醋酸鹽緩沖鹽終止反應(yīng)后使用截留分子量14000的透析袋在去離子水中透析3天；過濾，在-80 °C冷凍，干燥得到咪唑化白蛋白(BH)。
[0026]實(shí)施例2
在攪拌條件下，將17.2g硫酸胍基丁胺(Agm)加入到50ml 50% (W/V)人血清白蛋白(HSA)的中性磷酸鹽緩沖溶液中，然后使用1M HC1溶液調(diào)節(jié)體系的pH值到4.75，最后加入
4.5g 1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HC1)進(jìn)行催化，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6h0加入4M醋酸鹽緩沖鹽終止反應(yīng)后使用截留分子量14000的透析袋在去離子水中透析3天；過濾，在-80 V冷凍，干燥得到胍基化白蛋白(HSA-Agm)。
[0027]實(shí)施例3
在攪拌條件下，將15.252g精胺(SPE)加入到50ml 50% (W/V)人血清白蛋白(HSA)的中性磷酸鹽緩沖溶液中，然后使用1M HC1溶液調(diào)節(jié)體系的pH值到4.75，最后加入4.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHC1)進(jìn)行催化，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6h。加入4M醋酸鹽緩沖鹽終止反應(yīng)后使用截留分子量14000的透析袋在去離子水中透析3天；過濾，在-80 V冷凍，干燥得到胍基化白蛋白(HSA-SPE)。
[0028]實(shí)施例4
如圖2所示，BH的表征(元素分析、SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)、緩沖能力試驗(yàn))
2.1首先利用元素分析儀測定BH中各元素(C、H、N)的含量，通過含氮量的變化計(jì)算組胺的接枝量，進(jìn)而計(jì)算出BH的分子量。
[0029]2.2使用SDS-PAGE電泳證明接枝前后分子量發(fā)生變化，本試驗(yàn)根據(jù)分子篩原理，分子大小不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生不同的迀移率，電泳后在不同的水平位置出現(xiàn)蛋白條帶。具體操作如下:
2.2.1配制濃度為10%的SDS-PAGE凝膠電泳
2.2.2蛋白變性，稱取濃度為lmg/ml為BSA及BH，加入相應(yīng)量的上樣緩沖液，在100°C沸水浴中煮沸5min。
[0030]2.2.3上樣后電泳，分別加入5yL蛋白Marker、4yL BSA、4yL BH，然后在100V電壓下進(jìn)行電泳，2h后停止。
[0031]2.2.4使用去離子水清洗