V71的感染。
[0015] 本發(fā)明的第一方面，提供了蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因（FYN)作為抗腸道病毒71 型感染的新靶點(diǎn)。
[0016] 本發(fā)明的第二方面，提供了蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因（FYN)在制備預(yù)防或治療 腸道病毒71型感染藥物中的應(yīng)用。
[0017] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因（FYN)在制備預(yù)防或治療手 足口病藥物中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明所述的FYN在制備預(yù)防或治療腸道病毒71型感染藥物中的應(yīng)用，以及在制 備預(yù)防或治療手足口病藥物中的應(yīng)用，所述的藥物具體是指能夠抑制或下調(diào)FYN表達(dá)量的 試劑。
[0019] 所述的抑制或下調(diào)FYN表達(dá)量的試劑可以是siRNA、shRNA、包含siRNA、shRNA的 重組載體（如質(zhì)粒）等。
[0020] 本發(fā)明的第三方面，提供了蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因（FYN)的干擾RNA在制備 預(yù)防或治療腸道病毒71型感染藥物中的應(yīng)用，以及在制備預(yù)防或治療手足口病藥物中的 應(yīng)用，所述的干擾RNA (siRNA)的序列選自以下任一：
[0021] GCUCUGAAAUUACCAAAUCUU(SEQ ID N0:22)、
[0022] AUGAAUUAUAUCCAUAGAGAU(SEQ ID N0:23)、
[0023] GCCUCUUUGUCUAAAACAAUA(SEQ ID N0:24)。
[0024] 其中，以如SEQ ID N0:22所示的siRNA下調(diào)FYN的表達(dá)量效果最佳，且降低EV71 對(duì)HBMEC細(xì)胞的感染最為明顯。
[0025] 本發(fā)明篩選到能夠抑制EV71感染HBMEC細(xì)胞的新宿主細(xì)胞分子FYN以及EFS分 子。FYN或EFS分子基因下調(diào)以后，不影響細(xì)胞正常的生理功能，但明顯抑制了 EV71對(duì) HBMEC細(xì)胞的感染。因此本發(fā)明為臨床預(yù)防和治療因 EV71感染所導(dǎo)致的血腦屏障的失能提 供了新的靶點(diǎn)和治療方案。
【附圖說明】
[0026] 圖1為轉(zhuǎn)染有效siRNA后的干擾效率及細(xì)胞毒性檢測(cè)，圖中主坐標(biāo)軸表示干擾效 率，次坐標(biāo)軸表示對(duì)細(xì)胞毒性的影響；
[0027] CTRL :不轉(zhuǎn)染任何siRNA的HBMEC細(xì)胞組（空細(xì)胞組）；
[0028] NT :轉(zhuǎn)染 non-targeting siRNA 的 HBMEC 細(xì)胞組（陰性對(duì)照組）；
[0029] siRNA :轉(zhuǎn)染針對(duì)各目的基因的siRNA的HBMEC細(xì)胞組（實(shí)驗(yàn)組）。
[0030] 圖2為免疫熒光法檢測(cè)各宿主分子下調(diào)后對(duì)EV71感染的影響，其中A為下調(diào)各分 子后對(duì)病毒感染性的焚光觀測(cè)圖，B為下調(diào)各分子后對(duì)病毒感染的抑制率圖。
[0031] CTRL :不轉(zhuǎn)染任何siRNA的HBMEC細(xì)胞組（空細(xì)胞組）
[0032] NT :轉(zhuǎn)染 non-targeting siRNA 的 HBMEC 細(xì)胞組（陰性對(duì)照組）
[0033] siRNA :轉(zhuǎn)染針對(duì)各目的基因的siRNA的HBMEC細(xì)胞組（實(shí)驗(yàn)組）
[0034] 圖3為EFS下調(diào)后對(duì)EV71感染的影響，其中A為Western Blot檢測(cè)EFS蛋白的 表達(dá)圖，B為觀察EV71的細(xì)胞病變效應(yīng)圖，C為檢測(cè)EV71病毒量圖。
[0035] CTRL :不轉(zhuǎn)染任何siRNA的HBMEC細(xì)胞組（空細(xì)胞組）
[0036] NT-CTRL :轉(zhuǎn)染 non-targeting siRNA 的 HBMEC 細(xì)胞組（陰性對(duì)照組）
[0037] EFS :轉(zhuǎn)染針對(duì) EFS 基因的 siRNA (SEQ ID N0:18)的 HBMEC 細(xì)胞組
[0038] 圖4為FYN下調(diào)后對(duì)EV71感染的影響，其中A為Western Blot檢測(cè)FYN蛋白的 表達(dá)圖，B為觀察EV71的細(xì)胞病變效應(yīng)圖，C為檢測(cè)EV71病毒量圖。
[0039] CTRL :不轉(zhuǎn)染任何siRNA的HBMEC細(xì)胞組（空細(xì)胞組）
[0040] NT-CTRL :轉(zhuǎn)染 non-targeting siRNA 的 HBMEC 細(xì)胞組（陰性對(duì)照組）
[0041] FYN :轉(zhuǎn)染針對(duì) EFS 基因的 siRNA(SEQ ID N0:22)的 HBMEC 細(xì)胞組
[0042] 圖5為轉(zhuǎn)染EFS分子的不同干擾序列后的干擾效率及對(duì)EV71感染性的影響圖，A 為EFS基因的mRNA水平檢測(cè)圖，B為EV71病毒量檢測(cè)圖。
[0043] CTRL :不轉(zhuǎn)染任何siRNA的HBMEC細(xì)胞組（空細(xì)胞組）
[0044] NT-CTRL :轉(zhuǎn)染 non-targeting siRNA 的 HBMEC 細(xì)胞組（陰性對(duì)照組）
[0045] EFS-16 :轉(zhuǎn)染針對(duì) EFS 基因的 siRNA(SEQ ID N0:16)的 HBMEC 細(xì)胞組
[0046] EFS-17 :轉(zhuǎn)染針對(duì) EFS 基因的 siRNA (SEQ ID NO: 17)的 HBMEC 細(xì)胞組
[0047] EFS-18 :轉(zhuǎn)染針對(duì) EFS 基因的 siRNA (SEQ ID NO: 18)的 HBMEC 細(xì)胞組
[0048] 圖6為轉(zhuǎn)染FYN分子的不同干擾序列后的干擾效率及對(duì)EV71感染性的影響圖，A 為FYN基因的mRNA水平檢測(cè)圖，B為EV71病毒量檢測(cè)圖。
[0049] CTRL :不轉(zhuǎn)染任何siRNA的HBMEC細(xì)胞組（空細(xì)胞組）
[0050] NT-CTRL :轉(zhuǎn)染 non-targeting siRNA 的 HBMEC 細(xì)胞組（陰性對(duì)照組）
[0051] FYN-22 :轉(zhuǎn)染針對(duì) FYN 基因的 siRNA(SEQ ID N0:22)的 HBMEC 細(xì)胞組
[0052] FYN-23 :轉(zhuǎn)染針對(duì) FYN 基因的 siRNA(SEQ ID NO: 23)的 HBMEC 細(xì)胞組
[0053] FYN-24 :轉(zhuǎn)染針對(duì) FYN 基因的 siRNA (SEQ ID NO: 24)的 HBMEC 細(xì)胞組
【具體實(shí)施方式】
[0054] 現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。
[0055] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻(xiàn)方法制備。下列實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室指南》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照常規(guī)條件，或 按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0056] 實(shí)施例1 :
[0057] 1設(shè)計(jì)、合成各宿主細(xì)胞分子的特異性siRNA序列。
[0058] 1. 1針對(duì)各個(gè)目的基因，檢索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用現(xiàn)有 的網(wǎng)絡(luò)資源及常用軟件對(duì)各目的基因進(jìn)行生物學(xué)分析，選擇編碼區(qū)作為siRNA設(shè)計(jì)的靶序 列。參照siRNA設(shè)計(jì)原則，并通過GeneBank數(shù)據(jù)庫的blast功能與人類基因組序列進(jìn)行對(duì) 比，確保無同源性；排除aitisense鏈的5'端連續(xù)8個(gè)堿基與其它基因配對(duì)的潛在siRNA ; 排除任何一段連續(xù)14個(gè)堿基與其它基因配對(duì)的潛在siRNA。并利用設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行預(yù)評(píng)估測(cè) 定，選擇3個(gè)最佳的動(dòng)力學(xué)參數(shù)靶點(diǎn)進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)流程，每一基因共合成3條干擾序列，見 表1。
[0059] 1. 2單鏈siRNA的合成與純化由Invitrogen公司完成。
[0060] 表1 · s i RNA靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)
[0061]
[0062] 2siRNA序列篩選與干擾效果鑒定
[0063] 2. 1RNA 轉(zhuǎn)染
[0064] 轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000說明書
[0065] 1)提前12-16小時(shí)將HBMEC細(xì)胞（購自Sciencell，保藏號(hào)：1000)鋪在24孔細(xì) 胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，使得轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為80 % -90 %。
[0066] 2)取 2 μ LLipofectamine 2000 加入 50 μ Lopti-MEM 中并輕柔混勻，室溫孵育 5 分鐘；另取5 μ L濃度為5 μΜ的干擾RNA和50 μ Lopti-MEM混合。孵育結(jié)束后，將稀釋的 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑加入稀釋的RNA中，并輕柔吹吸混勻。室溫孵育20min后，加 入HBMEC細(xì)胞中，補(bǔ)加400 μ Lopti-MEM，使得RNA終濃度為50nM。
[0067] 3)轉(zhuǎn)染后6-8小時(shí)更換含有雙抗的新鮮培養(yǎng)基。
[0068] 2. 2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)各宿主分子的mRNA水平
[0069] 1) TRIzol提取對(duì)照組與干擾組細(xì)胞的總RNA，具體步驟如下：
[0070] 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，去培養(yǎng)上清，在細(xì)胞中加入1ml TRIzol，充分混合室溫裂解細(xì)胞 3-5分鐘。加入1/5體積的氯仿，手動(dòng)劇烈混合15秒。于4°C、12, 000轉(zhuǎn)離心15分鐘。取 上層水相并轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入等體積異丙醇，充分混合，室溫沉淀10分鐘。于4°C、 12, 000轉(zhuǎn)離心10分鐘。棄上清，加入lml預(yù)冷的75%乙醇。于4°C、12, 000離心5分鐘。 充分棄上清，室溫晾干RNA沉淀，加入DEPC處理水溶解沉淀，得到總RNA。
[0071] 2)利用takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取對(duì)照組與干擾組細(xì)胞的cDNA，具體步驟如下：
[0072] 在PCR管中加入如下反應(yīng)體系，
[0074] 輕柔混合混勻，置于37°C反應(yīng)15分鐘，然后置于85°C加熱5秒鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0075] 3)熒光定量RT-PCR檢測(cè)
[0076] 利用takara的SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系如下，
[0079] 利用Rotor Gene 3000A儀器進(jìn)行兩步法擴(kuò)增，95°C預(yù)變性2min，進(jìn)行40個(gè)PCR循 環(huán)，95°C 5 秒，60°C 30 秒。
[0080] 3細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
[0081] 采用CCK-8方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)細(xì)胞增殖的影響，具體步驟如下：
[0082] 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔3000個(gè)的密度接種于96孔板。待細(xì)胞過夜貼壁 后，轉(zhuǎn)染各siRNA，培養(yǎng)48小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。棄去原有培養(yǎng)基，每孔加入含10 μ L CCK-8的新鮮培養(yǎng)基110 μ L，培養(yǎng)3h后用多功能酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值。 實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)算平均值。
[0083] 4EV71病毒感染HBMEC細(xì)胞
[0084] 4. 1HBMEC細(xì)胞的EV71病毒感染實(shí)驗(yàn)
[0085] HBMEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染RNA后72小時(shí)，進(jìn)行EV71病毒感染實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)上清吸出，用預(yù) 溫PBS潤(rùn)洗2次，以Μ0Ι = 0. 1的病毒量接種EV71，37°C孵育2h后棄去病毒液，并用預(yù)溫 PBS潤(rùn)洗3次，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
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