人參皂苷Rg1在制備預(yù)防和/或治療心肌缺血的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物的應(yīng)用，特別涉及一種人參皂苷Rgl對心肌缺血的改善作用 的研究。
【背景技術(shù)】：
[0002] 冠心病已經(jīng)位居中國和國外主要發(fā)達(dá)國家的致死率的前三位，并且，其發(fā)病率呈 現(xiàn)逐年上升的趨勢 [1]。急性心肌梗塞（AMI)仍是全球死亡和殘疾的主要原因。急性心梗發(fā) 生之后，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneouscoronaryintervention,PCI)已成為臨 床上最常用的治療手段，雖然PCI可以恢復(fù)心臟的灌注，但是，并不能降低穩(wěn)定性心絞痛患 者的死亡率[2]，再灌注本身能導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的過程，稱為心肌再灌注損傷（ischemia/ reperfusion,I/R),PCI引起的缺血再灌注損傷是介入后患者出現(xiàn)心臟事件的主要病理基 礎(chǔ)。目前仍然沒有有效的療法。許多新的治療策略目前正在研究中。防止心肌再灌注損傷 有望能改善患者的臨床結(jié)局。
[0003] 缺血再灌注損傷的機(jī)制主要為自由基的產(chǎn)生，微血管的損傷，細(xì)胞內(nèi)鈣的超載，炎 性因子的產(chǎn)生，心肌細(xì)胞凋亡，血小板、中性粒細(xì)胞和補(bǔ)體的活化等 [3'4]。其中能量代謝異 常、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)在I/R引起的心臟微循環(huán)障礙和心肌組織損傷中扮演了重要的角 色。心肌缺血期，因缺少氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)提供，加上ATP合成酶δ亞基ATP?低表達(dá)[5]， 導(dǎo)致了心肌ATP生成不足。另一方面，心肌泵血耗氧，又致ATP降解增多。ADP、AMP、次黃 嘌呤堆積。ATP減少進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞骨架細(xì)肌絲的F-actin聚合受阻，使其ATP合成酶水 平進(jìn)一步降低，心肌收縮力下降[6]。ATP減少是缺血期心肌收縮蛋白損傷的主要因素之一。 F-actin是心肌細(xì)絲的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其降解是心肌纖維損傷的基礎(chǔ)。MLC2是粗肌絲上的肌動(dòng) 蛋白輕鏈，MLC2的磷酸化可以引起心肌收縮舒張功能減低。I/R引起的能量代謝異常和 過量產(chǎn)生的過氧化物破壞了心肌肌絲骨架蛋白[7]。介入或溶栓開通血運(yùn)后（再灌注），提 供的水和氧，在次黃嘌呤氧化酶的作用下生成負(fù)氧陰離子，進(jìn)而產(chǎn)生過氧化氫。細(xì)胞膜磷 脂結(jié)構(gòu)中不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，生成脂質(zhì)過氧化物，再經(jīng)過氧化物酶分解生成丙 二醛（MDA)，最終使細(xì)胞膜磷脂結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。這些活性氧自由基（R0S) -方面可以直接 與磷脂膜、蛋白和DNA直接反應(yīng)，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和功能受損M ;另一方面，又可以激活 核因子kB(nuclearfactorkB，NF-kB)，通過NF-κΒ啟動(dòng)炎性因子和粘附因子的表達(dá)， 促進(jìn)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互反應(yīng)和游出[9]，加重血管和心肌損傷。過量的R0S還可 造成線粒體的去極化和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrialpermeabilitytransition pore,mPTP)的長期開放，導(dǎo)致細(xì)胞色素c的釋放和線粒體誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[1°]。
[0004]Rho激酶（Rho-kinase,ROCK)在心臟缺血再灌注所致心肌細(xì)胞凋亡中扮演了重要 的角色。ROCK為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，其分子量大約為160KD，ROCK可以介 導(dǎo)下游一系列蛋白的磷酸化/脫磷酸化反應(yīng)，最具代表性的ROCK的下游底物是肌球蛋白 輕鏈磷酸酶（MLCP)和肌球蛋白磷酸酶（MYPT-1)?；罨腞ho激酶使MYPT-1磷酸化，進(jìn)一 步使MLCP失活，失活的MLCP不能將肌球蛋白輕鏈（MLC)脫磷酸化，使得磷酸化的MLC增加， 引起心肌收縮功能障礙。已有研究表明ROCK可通過調(diào)節(jié)PTEN的功能，最終抑制細(xì)胞內(nèi) 重要的蛋白激酶Akt的激活[11]。在再灌注初期，抑制了ROCK的激活，可以減少心肌梗死面 積，其機(jī)制涉及到PI3K/Akt/eN0S途徑[12]。Akt，也被稱為蛋白激酶B(PKB)，是磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K)下游主要的效應(yīng)物。PI3K/AKT信號通路是參與細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要的信號 通路?；罨腜I3K以磷酸化形式出現(xiàn)，進(jìn)一步激活A(yù)kt，AKT下游底物非常多，包括NF-κB、 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)、F〇rkhead轉(zhuǎn)錄因子（F0X0)等等，多是促進(jìn)增殖、抑制凋亡的因 子，從而發(fā)揮抗凋亡作用。PI3K及其下游分子所介導(dǎo)的抗凋亡作用已經(jīng)成為藥物研究領(lǐng)域 的焦點(diǎn)。
[0005] 人參阜苷Rgl(ginsenosideRgl,Rgl)是人參中分離出的單體阜苷之一，具有廣泛 的生物學(xué)活性。大量的研究表明人參皂苷對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)都有影響，可 以抑制細(xì)胞凋亡、擴(kuò)張血管、改善心功能、抗衰老、美容等作用。其作用機(jī)制涉及多個(gè)信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)通路，如人參阜苷Rgl(ginsenosideRgl,Rgl)可以通過升高超氧化物歧化酶而抑制缺氧 再給氧中心肌細(xì)胞的氧化損傷[13]。Rgl還可以通過增加急性心肌梗死大鼠血管內(nèi)皮生長因 子的水平而增加梗死區(qū)域的血管新生，從而起到心肌保護(hù)的作用 [14]。最新研究表明，Rgl可 以通過增加心肌細(xì)胞中ATP的含量以及抗氧化的作用抑制缺氧再給氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的 自噬，從而起到心肌的保護(hù)作用[15]。此外，與Rbl作用相似，Rgl可以降低PGF-2CI誘導(dǎo)的 心肌細(xì)胞肥大[16]。Rgl還可以抑制脂多糖（LPS)誘導(dǎo)的NFkB和MAPK等細(xì)胞內(nèi)促炎因子 的信號傳導(dǎo)途徑，而且沒有糖皮質(zhì)激素的副作用[17]。但目前尚無體內(nèi)試驗(yàn)的證據(jù)，從能量 代謝、抑制炎癥和細(xì)胞凋亡的角度，探討人參皂苷Rgl對大鼠心肌缺血再灌注損傷的改善 作用。
[0006] 本發(fā)明為深入研究人參皂苷Rgl對心功能的影響，對人參皂苷Rgl在缺血再灌注 損傷的心肌模型上的作用進(jìn)行了研究，意外的發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rgl對促炎性介質(zhì)的釋放；對 心肌能量代謝、心肌梗死面積、心肌組織F-actin染色、心肌組織HE染色、心肌超微結(jié)構(gòu)、心 肌凋亡和調(diào)控蛋白、心功能、心臟表面血流量等指標(biāo)都有影響。
[0007] 本發(fā)明人以此為依據(jù)，提出了本發(fā)明的構(gòu)想。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] 本發(fā)明提供一種人參皂苷Rgl的新的用途，特別是人參皂苷Rgl在缺血再灌注損 傷的心肌模型上展現(xiàn)出的作用。為此本發(fā)明提出如下的應(yīng)用
[0009] 人參皂苷Rgl在制備預(yù)防和/或治療心肌缺血的藥物中的應(yīng)用。
[0010] 其中，所述治療和/或預(yù)防心肌缺血是人參皂苷Rgl改善心肌能量代謝和心功能、 減少心肌梗死面積、改善心臟表面血流量。
[0011] 其中，所述治療和/或預(yù)防心肌缺血是人參皂苷Rgl能夠減輕I/R引起的心肌纖 維損傷，抑制I/R引起的心肌細(xì)胞凋亡。
[0012] 其中，所述治療和/或預(yù)防心肌缺血是人參皂苷Rgl可顯著性的抑制I/R引起的 ADP/ATP、AMP/ATP比值的升高。
[0013] 其中，所述治療和/或預(yù)防心肌缺血是人參皂苷Rgl能夠提高心肌中ATP-?mRNA 和蛋白的表達(dá)水平，降低MLC的磷酸化水平。
[0014]其中，所述治療和/或預(yù)防心肌缺血是人參皂苷Rgl能夠抑制I/R引起的MDA含 量的升
[0015]其中，所述治療和/或預(yù)防心肌缺血是人參皂苷Rgl對促炎性介質(zhì)的釋放和細(xì)胞 凋亡具有抑制作用。
[0016]其中，所述治療和/或預(yù)防心肌缺血是人參皂苷Rgl能夠改善I/R組心肌細(xì)胞漿 中NF-κBP65水平的降低，細(xì)胞核中NF-κBP65的表達(dá)升高。
[0017]其中，所述治療和/或預(yù)防心肌缺血是人參皂苷Rgl能夠抑制I/R引起的ΜΡ0、ICAM-1、⑶18表達(dá)的增強(qiáng)；能夠抑制心肌組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax和cleaved-Caspase-3的表達(dá)。
[0018]其中，所述治療和/或預(yù)防心肌缺血是人參皂苷Rgl預(yù)防性給藥能夠抑制I/R導(dǎo) 致的ROCK的激活以及其底物MYPT-1的磷酸化水平。
[0019]本發(fā)明所述的人參皂苷Rgl包括市售的純度在10% -98%的人參皂苷Rgl，也可通 過現(xiàn)有技術(shù)提取分離。
[0020] 優(yōu)選的本發(fā)明的純度在50%以上，優(yōu)選80%以上，最有選90%以上。
[0021] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中所使用的人參皂苷Rgl為市場上購買得到，純度在90%以上。
[0022] 本發(fā)明所述的應(yīng)用。其中所述藥物是指包括人參皂苷Rgl的藥物組合物，是用上 述所述的人參皂苷Rgl作為藥物活性成分制備成的藥物制劑組合物。優(yōu)選以人參皂苷Rgl 為唯一活性成分。
[0023]本發(fā)明的藥物制劑組合物，根據(jù)需要可以含有藥物可接受的載體，其中人參皂苷Rgl作為藥物活性成分，其在制劑中所占重量百分比可以是〇. 1-99.9%，其余為藥物可接 受的載體。本發(fā)明的藥物制劑組合物，以單位劑量形式存在，所述單位劑量形式是指制劑的 單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋，注射劑的每支等。
[0024]本發(fā)明的藥物制劑組合物可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括：片劑、糖衣片 劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、 丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜?jiǎng)?、噴霧劑、 滴劑、貼劑。
[0025]本發(fā)明的中藥制劑，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充 劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時(shí)可對片劑進(jìn)行包衣。 [0026]適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包 括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬 脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉。
[0027]可通過混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進(jìn)行反復(fù)混合可使活 性物質(zhì)分布在整個(gè)使用大量填充劑的那些組合物中。
[0028] 口服液體制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑， 或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品。這種液體制劑可含 有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基 纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉 伯膠；非水性載體（它們可以包括食用油），例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性 酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需 要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。
[0029] 對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無菌載體。根據(jù)載體 和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質(zhì)溶解在一種載 體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉 劑、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這 種組合物冰凍，并在真空下將水除去。
[0030] 本發(fā)明的中藥制劑，在制備成藥劑時(shí)可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體， 所述藥物可接受的載體選自：甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸 半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、醋酸 鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥 芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其 衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性 劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。
[0031] 本發(fā)明的制劑在使用時(shí)根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次1-20 劑，如：1-20袋或?；蚱?，每劑lmg-1000mg。
[0032] 本發(fā)明所述的治療用途是通過以下實(shí)驗(yàn)證明的：
[0033] 2材料與方法
[0034] 2. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0035] 雄性SD大鼠，體重240-260g，144只，隨機(jī)分為4組，每組36只，分別為假手術(shù)組 (Sham);本底組（Rgl+Sham);模型組（I/R);預(yù)給藥組（Rgl+1/R)。購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng) 物中心，合格證號：SCXK(京）2006 - 0008。動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF級動(dòng)物室，溫度為22±2°C，濕 度為40±5%的條件下，自由飲食、飲水，12小時(shí)光照/黑暗交替。動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前禁食12小 時(shí)，但可自由飲水。
[0036] 2.2藥品
[0037]Rgl購買自昆明風(fēng)山漸醫(yī)藥研究有限公司（云南，中國），純度為（>98% )，4°C保 存?zhèn)溆?，使用時(shí)用生理鹽水溶解。Rgl給藥劑量為lmg/kg、5mg/kg、10mg/kg，在實(shí)驗(yàn)前溶于 2. 5ml生理鹽水，濃度為 0· 25mg/mL、l. 25mg/mL、2. 5mg/mL現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0038] 2. 3主要儀器：
[0039] (1)正置熒光顯微鏡：U25LBD，Olympus，東京，日本；
[0040] (2)超敏感攝像頭：USS-301，UNIQVision，CA，美國；
[0041] (3)汞燈光源：0LYMPUS，220-240V，1. 8A，50-60Hz，東京，日本；
[0042] (4)彩色攝像頭：TK-C920EC，JVC,東京，日本；
[0043] (5)彩色監(jiān)視器：20PF5120,PHILIPS，東京，日本；
[0044] (6)圖像合成器：SP_460colorquadprocessor，SUNSP0,東京，日本；
[0045] (7)DVD刻錄機(jī)：DVDR560H/93,PHILIPS，東京，日本；
[0046] (8)時(shí)間視頻顯示器：VTG-33,FOR.A，東京，日本；
[0047] (9)冷光源：SJ8038HA2,SANJUN，北京，中國；
[0048] (10)恒溫水浴鍋：HW-SY11-K1，北京市長風(fēng)儀器儀表公司，中國；
[0049] (11)4°C離心機(jī)：Centrifuge5417R，Eppendorf，Hamburg，德國；
[0050] (12)高速離心機(jī)：Allegra64R，Beckman，PaloAlto,CA,美國；
[0051] (Π)分析天平：CPM，SartoriusAG,Goettingen,德國；
[0052] (14)激光共聚焦顯微鏡：Radiance2100,Bio-Rad,Hercules,CA,美國；
[0053] (1?5)多功能酶標(biāo)儀（Genef5):Synergy2,Bio-Rad,Hercules,CA，美國；
[0054] 2. 4試劑及配制
[0055] (1)烏拉坦：購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號：T20090119,用生理 鹽水配制成20%溶液，常溫保存；
[0056] (2) 2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（2, 3, 5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC): 購自美國AMRESC0有限公司，用磷酸鹽緩沖液溶解為濃度2. 0%的溶液，室溫保存；
[0057] (3)伊文斯氏藍(lán)（Evansblue):購自Sigma公司，生理鹽水配制成4%溶液；
[0058] (4)PBS:購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，使用前每包加入蒸餾水定容至 2L，充分溶解后分裝待用；
[0059] (5)二甲基亞諷（DMS0) :Sigma，St.Louis，Mo,美國；
[0060] (6)Dichlorofluorescein(DCFH-DA):批號：D6883,Sigma，St.Louis，M0,美國，儲(chǔ) 存液用DMS0配制成50mM，使用終濃度為5μΜ;
[0061] (7)Hoechst33342 :Invitrogen，St.Louis，Μ0,美國，儲(chǔ)存液lmg/ml，終濃度為 10μg/ml