一種抑制ras原癌基因過表達的抗腫瘤藥物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生脈提取物及其制備方法，具體涉及生脈提取物在制備抑制ras 原癌基因過表達的抗腫瘤藥物中的應用和在抑制ras原癌基因過表達中的應用，屬于醫(yī)藥 領域。
【背景技術】
[0002] 生脈散是中醫(yī)千古名方，首載于金代醫(yī)家張元素所著《醫(yī)學啟源·卷下》"麥門冬" 條內(nèi)；內(nèi)外傷辨惑論及醫(yī)方考中也有記載。由人參、麥冬、五味子組成，意在取"人參之甘補 氣，麥門（即麥冬）苦寒瀉熱補水之源，五味子之酸清肅燥金"。
[0003] 生脈散最早用于治療暑熱汗多，氣陰兩傷之證，表現(xiàn)為汗多、身疲、體倦、氣短、咽 干、脈虛等癥狀。古代醫(yī)家也用于金葉耗傷，脈微欲絕等癥狀，又用作氣陰兩虛病人的補益 劑。此方經(jīng)過幾百年的長期使用，安全有效，經(jīng)久不衰。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，生脈散的臨 床應用不斷擴大，其劑型除散劑外，還有生脈飲、生脈注射液；該方劑經(jīng)加減變化后還發(fā)展 了參麥飲和生脈散黨參方等?，F(xiàn)在主要用于治療心血管病中的抗休克、抗心衰、抗心肌缺血 等癥狀、糖尿病、慢性支氣管炎，各類心源性休克、冠心病、心律失常等。
[0004] 湯銘新等發(fā)現(xiàn)生脈散可顯著抑制肺癌的自發(fā)轉移，但是實驗證明這種抗腫瘤作用 并非生脈散直接作用于癌細胞，而是通過提高機體免疫功能間接實現(xiàn)抗腫瘤。中國專利 201010148044. 0公開了一種具有抗腫瘤作用的組合物及其在制備治療腫瘤藥物中的應用， 該專利將生脈散與其他中藥復方添加到以含主藥蟾酥的抗腫瘤藥物組合物中，生脈散減少 了蟾酥所帶來的心臟毒性問題；中國專利200510053562. 9公開了生脈注射液在制備治療 腫瘤減毒藥物中的用途，在對荷瘤小鼠化療過程中，同時應用生脈散可保護肝腎功能。中國 專利03142266. 7公開了生脈注射液在制備治療腫瘤增效藥物中的用途。該專利中應用生 脈散注射液處理結腸癌、乳腺癌、肝癌和胰腺癌細胞株，證明生脈注射液單獨應用時的抗腫 瘤作用效果時有時無，生脈散僅具較穩(wěn)定的協(xié)同增效作用。
[0005] 約30%的人類腫瘤是由于ras原癌基因突變后激活導致RAS蛋白表達水平增高造 成的。若RAS蛋白持續(xù)處于活化狀態(tài)，可與下游的效應蛋白結合，將信號傳遞到下游信號元 件，引起細胞的異常增殖，導致腫瘤的發(fā)生。因此，ras原癌基因已成為公認的篩選抗相關 惡性腫瘤藥物的靶標。
[0006] 生脈散僅用水煎的方法可以顯著抑制評估抑制ras原癌基因通路過度激活藥物 的模型秀麗隱桿線蟲ras通路的過度激活，但是同時具有顯著毒性，能導致模式生物秀麗 隱桿線蟲死亡。本發(fā)明提供了一種生脈提取物的制備工藝，與單純的水煎處理相比，在保證 能夠顯著抑制秀麗隱桿線蟲ras通路過度激活的同時，可以顯著降低毒性，對秀麗隱桿線 蟲的致死率低，效果更好。另外，本發(fā)明提供了生脈提取物的新用途，可在抑制ras原癌基 因過表達中應用和在制備由ras原癌基因過表達導致的腫瘤藥物中應用，有望開發(fā)成新一 代的抗腫瘤藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種生脈提取物及其制備工藝，以期提供一種毒性小，廉價 的藥物，本發(fā)明的另一目的是提供一種生脈提取物的新用途，具體涉及生脈提取物在制備 抑制ras原癌基因過表達的抗腫瘤藥物中的應用和在抑制ras原癌基因過表達中的應用。
[0008] 本發(fā)明通過下述技術方案予以實施。
[0009] 本發(fā)明所述的一種生脈提取物，其中生脈提取物是由下列方法制備的：取人參、麥 冬和五味子，加水，浸泡，加熱回流，過濾，減壓濃縮，得總浸膏；將總浸膏用蒸餾水完全溶 解，上大孔樹脂柱，吸附24h，之后用洗脫液洗脫，洗脫液濃縮至稠膏，干燥，即得。
[0010] 本發(fā)明所述的一種生脈提取物，以人參、麥冬、五味子為原料制成，所述原料藥的 質(zhì)量比為9 :9 :6。
[0011] 本發(fā)明所述的一種生脈提取物，在制備時所述的大孔樹脂為D101型大孔樹脂。
[0012] 本發(fā)明所述的一種生脈提取物，所述的生脈提取物總浸膏分離純化洗脫時的洗脫 量為5倍柱體積。
[0013] 本發(fā)明所述的一種生脈提取物，其特征在于，所述生脈提取物總浸膏在洗脫時的 洗脫液為乙醇溶液。
[0014] 本發(fā)明所述的一種生脈提取物，其特征在于，所述洗脫時所用的乙醇溶液是無水 乙醇。此時，在保證生脈提取物使秀麗隱桿線蟲MT2124的野生型比例顯著增加的同時，且 有效成分幾乎不顯示毒性。
[0015] 本發(fā)明為一種生脈提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，所述的腫瘤是由ras原癌 基因突變后過表達導致的。
[0016] 本發(fā)明為一種生脈提取物在抑制ras原癌基因過表達中的應用。
[0017] 本發(fā)明所述的生脈提取物在制備治療抗腫瘤藥物中的應用，可以將生脈提取物添 加藥學上可接受的載體如填充劑、潤滑劑、濕潤劑、促進吸收劑、吸附載體、稀釋劑、賦形劑 等，必要時可加入甜味劑、香味劑等，制備成注射劑、散劑、顆粒劑、粉劑、丸劑、口服液、片劑 等藥物的多種劑型，這是本領域技術人員可以理解的。
[0018] 本發(fā)明提供一種生脈提取物的制備工藝以及在制備抑制ras原癌基因過表達的 抗腫瘤藥物的新用途。本發(fā)明公開的生脈提取物的應用具有以下的優(yōu)勢：
[0019] (1)利用本發(fā)明中的制備工藝制備的生脈提取物效果好，能顯著降低毒性，使評 估抑制ras原癌基因通路過度激活藥物的模型秀麗隱桿線蟲的死亡率降低，野生型比例升 商。
[0020] (2)生脈提取物可以顯著抑制ras原癌基因過表達，可在制備治療由ras原癌基因 過表達導致的腫瘤藥物中應用。
[0021] (3)生脈提取物中人參、麥冬和五味子之間的組方配比可以根據(jù)中藥組方原則合 理改動，其仍然可以顯著下調(diào)ras原癌基因過度激活，具有抗腫瘤活性。
[0022] (4)生脈提取物僅僅作用于過表達的突變體RAS蛋白，而對野生型RAS蛋白無影 響。提示生脈提取物在應用上安全，它僅作用于癌細胞，而不會作用于正常細胞。今后，我 們有望將生脈提取物應用在抗相關惡性腫瘤藥物的制備中，其中，所述腫瘤是由ras原癌 基因的過表達導致的，從而為此類腫瘤患者提供更好的治療，為一些疑難癌癥的治療提供 新的途徑。
[0023] (5)生脈提取物顯著下調(diào)ras原癌基因過表達，并不是致突變引起的，不致畸。
[0024] (6)由于ras信號通路從線蟲到人高度保守，在秀麗隱桿線蟲中l(wèi)et-60基因編碼 保守的RAS蛋白，它與人類的RAS蛋白相比具有83%的同源性。如果ras突變，在秀麗隱 桿線蟲中會引起線蟲產(chǎn)生多陰門，在人類中則是引起細胞的惡性增殖，導致腫瘤的發(fā)生。因 此，模式生物秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans)Ras/MAPK信號通路過度激活型突變 體被作為受試群體廣泛應用于篩選抑制ras原癌基因通路過度激活的抗腫瘤藥物。因此， 本發(fā)明采用了秀麗隱桿線蟲突變株作為評估抑制ras原癌基因通路過度激活藥物的模型， 并得出了生脈提取物對ras原癌基因過表達有明顯下調(diào)作用、具有抑制ras原癌基因通路 過度激活的結論。
【具體實施方式】
[0025] 以下提供具體實施例來說明本發(fā)明，但不限于這些實施例。
[0026] 實施例一生脈復方的制備
[0027] 材料：人參、麥冬、五味子購自蘭州黃河市場。
[0028] (1)生脈水煎劑的制備
[0029] 稱取人參18g、麥冬18g、五味子12g;水煎，得總浸膏29g，溶于水，定容至100ml， 最后將所得樣品配制成2. 5mg/ml溶液備用，使用時可按倍數(shù)稀釋。
[0030] (2)生脈提取物的制備
[0031] 稱取人參18g、麥冬18g、五味子12g;水煎，得總浸膏29g，溶于水，定容至100ml; 用D101大孔樹脂裝填色譜柱，預處理，備用。取上述浸膏液20ml，上D101柱，分別用0%、 50%、無水乙醇溶液，5倍柱體積沖洗，最后將所得樣品配制成2. 5mg/ml溶液備用。
[0032] 實施例二生脈水煎劑對MT2124 (let-60過度激活突變）的作用
[0033] 1.原理
[0034] Ras是一種小分子蛋白，參與調(diào)控動物發(fā)育過程中的很多重要環(huán)節(jié)。ras信號通 路從線蟲到人高度保守，在秀麗隱桿線蟲中l(wèi)et-60基因編碼保守的RAS蛋白，它與人類 的RAS蛋白相比具有83%的同源性。如果ras突變，在秀麗隱桿線蟲中會引起線蟲產(chǎn)生多 陰門，在人類中則是引起細胞的惡性增殖，導致腫瘤的發(fā)生。因此，模式生物秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditis elegans)Ras/MAPK信號通路過度激活型突變體被作為受試群體廣泛應 用于篩選抑制原癌基因ras通路過度激活的抗腫瘤藥物。
[0035]MT2124是let-60/ras過度激活的秀麗隱桿線蟲，會產(chǎn)生多陰門的表型。將藥物稀 釋到一定的濃度，作用于秀麗隱桿線蟲MT2124,如果能夠抑制受試線蟲群體多陰門產(chǎn)生個 體的比例，而只有一個真陰門的野生型線蟲個體比例上升，則說明藥物作用于ras通路，下 調(diào)了該通路的過度激活，具有抗腫瘤活性。群體中野生型線蟲的比例越高，則藥物作用效果 越顯著。
[0036] 2.實驗材料
[0037] 秀麗隱桿線蟲株：秀麗隱桿線蟲突變體MT2124,基因型為：let-60(nl046sd,gf) IV，購自CGC(CaenorhabditisGeneticsCenter);細菌株：尿啼陡滲漏突變型大腸桿菌 0P50,作為秀麗隱桿線蟲的食物，購買于CGC。
[0038]3.試劑的配制
[0039]NGM培養(yǎng)基：NaClL5g，K2HP04L3g，ΚΗ2Ρ048· 5g，蛋白胨L4g，瓊脂粉 8. 5g，補充蒸 饋水至500mL。滅菌后加入過濾除菌的500μL膽固醇（5mg/mL，無水乙醇配制），高壓蒸汽 滅菌的 500μLlmol/LMgS04, 500μLlmol/LCaCl2。
[0040]LB液體培養(yǎng)基：NaCllg，蛋白胨lg，酵母膏