一種泥螺寡肽在抗肺癌中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及泥螺酶解寡肽的應(yīng)用，具體涉及一種泥螺寡肽在抗肺癌藥物中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 泥螺（Bullactaexarata)，俗稱"吐鐵"、"黃泥螺"、"梅螺"等，屬軟體動物門、腹足 綱、后鰓亞綱、頭楣目、阿地螺科、泥螺屬，為太平洋西岸海水及咸淡水特產(chǎn)的種類，由貝殼 和軟體兩部分組成，含有豐富的蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵和維生素等成分，寡肽物質(zhì)豐富，在我國 廣泛分布于東海和黃海兩側(cè)的長江，是一種常見的水產(chǎn)品。
[0003] 惡性腫瘤是一類嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病，發(fā)病率越來越高，目前已有的 化療藥物雖對大多數(shù)腫瘤有一定的療效，但選擇性差、毒副反應(yīng)大、耐藥性等問題依然非常 明顯。因此，尋找高效、低毒、特異強(qiáng)的抗腫瘤藥物仍勢在必行。寡肽因其分子量小、無免疫 原性、活性高、副作用小，尤其是對多藥抗性的腫瘤細(xì)胞系也有很好的抑制活性。海洋生物 寡肽是目前海洋生物活性物質(zhì)研究的一個重要領(lǐng)域，一些生物活性寡肽常以非活性狀態(tài)存 在于蛋白質(zhì)中，這些蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白酶的水解作用，使得隱藏于其中的活性肽釋放出來，有 可能發(fā)揮出比蛋白質(zhì)更多的生物活性。例如：如鄧偉等發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白酶解寡肽對人宮頸癌 HeLa細(xì)胞株的體外生長有明顯的抑制作用；楊永芳等酶解紫貽貝所得的紫貽貝寡肽對前 列腺癌PC-3細(xì)胞和DU-145細(xì)胞有特異性的增殖抑制作用，并且對DU-145細(xì)胞的抑制作用 強(qiáng)于對PC-3細(xì)胞的增殖抑制作用；姚如永等研究泥蚶寡肽在0. 25-1. 0g·L1范圍內(nèi)，寡肽 能明顯的抑制肺癌細(xì)胞A549和Ketr-3細(xì)胞的增殖，同時(shí)還能抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，并呈 明顯的劑量依賴性。
[0004] 肺癌是對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，近年來許多國家都報(bào)道肺癌 的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位，女 性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。研究泥螺酶解寡肽對肺癌H1299腫瘤細(xì)胞的抑制作 用，對研究泥螺寡肽在抗肺癌藥物中的應(yīng)用具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是在酶解泥螺組織獲取泥螺寡肽的基礎(chǔ)上，提供一種 泥螺寡肽在抗肺癌藥物中的應(yīng)用，尤其是抗肺癌H1299腫瘤細(xì)胞。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種泥螺寡肽在抗肺癌H1299細(xì) 胞藥物中的應(yīng)用，其中藥物的具體實(shí)現(xiàn)形態(tài)可為片劑、膠囊劑、顆粒劑或丸劑等。
[0007] 所述泥螺寡肽的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所述。
[0008] 上述泥螺寡肽通過以下步驟制得：新鮮泥螺洗凈去殼，取泥螺組織搗碎，加入蒸餾 水勻漿，料液比為1: (3~4)，用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液將勻漿液的pH值調(diào)節(jié)為8~9， 加入0. 4~0. 5%勻漿液體積的胰蛋白酶，40~50°C保溫水解7~9h，水解完成后95~ 100°C、10~15min進(jìn)行滅酶，4°C下水解液于9500~10000r/min離心15~20min，取上清 液，經(jīng)3kd超濾膜超濾獲得分子量小于3kd的第一組分，將該第一組分經(jīng)凝膠層析洗脫收集 最低峰獲得第二組分，最后將該第二組分反相高效液相色譜分離獲得所述泥螺寡肽。
[0009] 作為優(yōu)選，所述凝膠層析條件如下：所述第一組分的濃度為48~50mg/mL、上樣量 為3~4mL、速度為2. 5~3. 5ml/min，流動相為超純水，280nm紫外檢測。
[0010] 作為優(yōu)選，所述反相高效液相條件如下：選用Zorbax SB-C18(4.6X250,5um);柱 溫為20°C;流動相為1 %TFA和乙腈；梯度洗脫：從開始到30min結(jié)束，乙腈濃度從0變化 到40%，洗脫速度為1.OmL/min;進(jìn)樣體積為50ul，紫外檢測波長分別為214nm、280nm。
[0011] 進(jìn)一步，6~14mg/ml所述泥螺寡肽作用于H1299細(xì)胞24~36h后，對肺癌H1299 細(xì)胞的增殖抑制率為21. 3~74. 3%，且增殖抑制率與泥螺寡肽的濃度呈正相關(guān)。
[0012] 再進(jìn)一步，6~14mg/ml所述泥螺寡肽作用于H1299細(xì)胞24h后，對肺癌H1299細(xì) 胞的早期凋亡和晚期凋亡的影響率分別為15~19. 74%和33~36. 43%，且增殖抑制率與 泥螺寡肽的濃度呈正相關(guān)
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明利用泥螺為原料，通過酶解提取泥螺 寡肽，泥螺為一種低值貝類，在我國廣泛分布，來源廣，成本低，并且本發(fā)明中泥螺寡肽的提 取方法溫和易控，工藝簡單，操作方便。本發(fā)明中的泥螺寡糖可對肺癌H1299腫瘤細(xì)胞顯著 抑制，其中對H1299細(xì)胞的增殖抑制率可達(dá)21. 3~74. 3%，對肺癌H1299細(xì)胞的早期凋亡 和晚期凋亡的影響率分別為15~19. 74%和33~36. 43%，可見具有顯著地抗腫瘤活性。 泥螺寡肽具有良好的開發(fā)前景，對泥螺寡糖的抗肺癌H1299腫瘤細(xì)胞的研究可為抗肺癌藥 物的開發(fā)研究提供理論支持。
【附圖說明】
[0014] 圖1為實(shí)施例1中第一組分的凝膠層析圖譜；
[0015] 圖2為實(shí)施例1中第二組分的高效液相色譜圖；
[0016] 圖3為實(shí)施例4中泥螺寡肽對肺癌H1299腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用與作用時(shí)間和 作用濃度關(guān)系折線圖；
[0017] 圖4為圖3的柱狀圖；
[0018] 圖5為實(shí)施例4中不同濃度的泥螺寡肽作用于與H1299細(xì)胞后的HE染色圖，A:對 照組，B:6mg/ml，C: 10mg/ml，D: 14mg/ml;
[0019] 圖6為實(shí)施例4中不同濃度的泥螺寡肽作用于與H1299細(xì)胞后的Α0/ΕΒ雙染熒光 圖，A:對照組，B:6mg/ml，C: 10mg/ml，D: 14mg/ml;
[0020] 圖7為實(shí)施例4中不同濃度的泥螺寡肽作用于與H1299細(xì)胞后的Annexin V-FITC/PI染色結(jié)果圖，A-1:對照組，A_2:6mg/ml，A_3:10mg/ml，A_4:14mg/ml。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0022] 實(shí)施例1 :泥螺寡肽的制備
[0023] (1. 1)原料處理
[0024] 取新鮮泥螺，將泥螺去殼、浙干后勻漿備用。
[0025](1. 2)泥螺酶解工藝
[0026] 用高速組織搗碎機(jī)將泥螺組織搗碎勻漿，精密稱取勻漿液，用0.lmol/L的鹽酸 溶液和〇.lmol/L的NaOH溶液調(diào)pH值，加入胰蛋白酶酶解數(shù)小時(shí)，酶解條件為酶解溫度 45°C，pH為8. 7,料液比1:4,酶解時(shí)間8h，加酶量0. 48%。100°C下滅酶15min，4°C下離心 15min(10000r/min)，取上清液濃縮備用。
[0027] (1. 3)泥螺多肽的分離純化
[0028] 首先選用超濾法對泥螺多肽酶解液進(jìn)行分離，超濾膜分別選用10kd，5kd，3kd，分 別截留到分子量l〇-5kd、5-3kd和小于3kd三個組分，冷凍干燥后分別配成20mg/mL的濃 度，用MTT法測定各個組分對肺癌H1299的抑制率。選出活性最高的第一組分（分子量小 于3kd)，選用SephadexG-25凝膠層析，裝柱后用去離子水平衡，濃度為50mg/mL、上樣4mL、 速度為3ml/min，流動相為超純水，280nm紫外檢測，凝膠層析曲線如圖1所示，收集最高洗 脫峰冷凍干燥成粉末，檢測對H1299細(xì)胞的增殖抑制率，并繪制曲線得出IC5。，將活性最高 的第二組分大量收集冷凍干燥進(jìn)行高效液相色譜分析獲取泥螺寡肽。
[0029] 將冷凍干燥好的第二組分用0.06%TFA的水溶解到0.6ml的離心管中，在 12000rpm，離心10min取上清液。高效液相條件：ZorbaxSB-C18(4.6X250,5um);柱溫為 20°C;流動相為1 %TFA和乙腈；梯度洗脫：從開始到30min結(jié)束，乙腈濃度從0變化到40%， 洗脫速度為L〇mL/min;進(jìn)樣體積為50ul紫外檢測波長分別為214nm、280nm。高效液相色 譜圖如圖2所述，分別收集洗脫峰A，即得泥螺寡肽。
[0030] 實(shí)施例2:泥螺寡肽氨基酸序列的測定
[0031]目標(biāo)多肽的氨基酸序列分析采用N末端氨基酸降解檢測方法測定。建立標(biāo)準(zhǔn)氨 基酸圖譜：利用混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（PTH-AA)，在常規(guī)條件下運(yùn)行生成一張標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖， 對混合氨基酸標(biāo)品的保留時(shí)間進(jìn)行校正，生成標(biāo)準(zhǔn)方法文件。樣品前處理：將純樣品離心 后取上清液備用；將聚凝胺（P〇lybrene)15ul加到玻璃纖維膜（GlassFiberDisk)上氮 氣吹干；上機(jī)將玻璃纖維膜預(yù)處理，即運(yùn)行5個循環(huán)將足量純樣品點(diǎn)加到預(yù)處理后的玻璃 纖維膜上，氮?dú)獯蹈伞Ｉ蠙C(jī)檢測：將加好樣品的玻璃纖維膜用PTFE濾膜封置于蛋白測序儀 PPSQ-31A的反應(yīng)器里，設(shè)定檢測氨基酸數(shù)及其他參數(shù)。
[0032] 本實(shí)施例中，收集經(jīng)高效液相色譜分離的泥螺寡肽，經(jīng)檢測該肽的氨基酸序列如 SEQIDNO. 1 所述。
[0033] 實(shí)施例3 :Η1299細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代
[0034] (3. 1)細(xì)胞復(fù)蘇
[0035] 從液氮罐中取出存放的Η1299細(xì)胞株，快速的放入37°C恒溫水浴鍋中進(jìn)行融化， 待融化后進(jìn)入無菌工作室進(jìn)行操作，用滅菌好的吸管將細(xì)胞株吸入離心管，加入2mL的F12 營養(yǎng)液或RPMI1640營養(yǎng)液，lOOOrpm離心10min，去上清液，加入4ml的營養(yǎng)液，反復(fù)吹打使 細(xì)胞成為單個細(xì)胞。然后用吸管將細(xì)胞均勻的吸入到2個25mL的培養(yǎng)瓶中，放入5%C02、 37°C的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日換液倒掉未貼壁的死亡細(xì)胞。
[0036](3. 2)細(xì)胞培養(yǎng)
[0037]將人肺癌細(xì)胞H1299接種到分別含有10 %胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)）FBS和雙抗（青 霉素G100IU/mL、鏈霉素100IU/mL)的F12和1640營養(yǎng)液中，放置于37°C、5%C02的恒溫培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，每1天換液一次，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶的80 %左右時(shí)進(jìn)行傳代。 按照1 : 2的比例進(jìn)行傳代，收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0038] (3· 3)細(xì)胞傳代
[0039] 先將長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶從恒溫培養(yǎng)箱中取出放到無菌操作臺上。傳代時(shí)，先倒掉 瓶中的營養(yǎng)液，去除不貼壁生長的死細(xì)胞，用〇. 25%胰蛋白酶/0. 02%EDTA消化液混合消 化，不同細(xì)胞消化的時(shí)間不同，一般消化時(shí)間為3-5min;顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞間隙明 顯變大且細(xì)胞變圓變亮?xí)r，說明細(xì)胞已經(jīng)消化完畢，去掉消化酶液。在培養(yǎng)瓶中加入2. 5mL 左右的營養(yǎng)液，反復(fù)吹打消化好的貼壁細(xì)胞使之成為單個細(xì)胞，一般情況下一瓶細(xì)胞傳2 瓶，將傳代好的細(xì)胞置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0040] (3. 4)細(xì)胞凍存
[0041] 顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞長到培養(yǎng)瓶的80%左右，選細(xì)胞形態(tài)好的進(jìn)行凍存，倒去培 養(yǎng)液，加入消化液對細(xì)胞進(jìn)行消化，鏡下觀察細(xì)胞間隙明顯時(shí)倒掉消化酶，再向培養(yǎng)瓶中加 入3mL左右的營養(yǎng)液，反復(fù)吹打使之成為單個細(xì)胞，吸入離心管內(nèi)，lOOOrpm，離心lOmin，小 心的吸棄