一種肺纖維化動(dòng)物模型的建立的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及利用血管緊張素II建立肺纖維化動(dòng)物模型 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺纖維化是一種進(jìn)行性致死性疾病，發(fā)病率逐年增加，死亡率相當(dāng)高，平均生存時(shí) 間2-2. 5年。目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，無(wú)有效的治療方法。因此，建立一種簡(jiǎn)便、成熟而 穩(wěn)定的符合肺纖維化發(fā)病過(guò)程的動(dòng)物模型，對(duì)深入研究肺纖維化發(fā)病機(jī)制、開發(fā)先進(jìn)的治 療方法具有極其重要的意義。
[0003]肺纖維化動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)生發(fā)展和新型藥物必不可少的實(shí)驗(yàn)手段。在嚴(yán)格 控制各種條件下，利用動(dòng)物模型，我們可以觀察肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展和疾病轉(zhuǎn)歸以及這些 不同改變?cè)谛螒B(tài)學(xué)、影像學(xué)和分子生物學(xué)上的表現(xiàn)等規(guī)律。目前肺纖維化模型有很多種，其 中以博萊霉素（BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化模型使用最多。BLM是具有抗腫瘤作用的多組分復(fù)合 抗生素，其毒副作用之一是引起肺纖維化，由于病理組織學(xué)改變與人類肺纖維化最為接近， 故被廣泛用于誘導(dǎo)肺纖維化模型。利用BLM進(jìn)行模型制備的途徑包括氣管給藥，經(jīng)鼻給藥， 靜脈注射，腹腔注射等，其中經(jīng)氣管給藥已是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的成熟方法。但是用BLM誘導(dǎo)的動(dòng) 物肺纖維化模型來(lái)推導(dǎo)人類肺纖維化，或者是研究BLM對(duì)人類肺的毒性，都有一定的局限 性，主要體現(xiàn)在：（1)與人類特發(fā)性肺纖維化（IPF)-般病程相比，氣管給藥BLM誘導(dǎo)的動(dòng)物 肺纖維化模型可以自然消散；（2)糖皮質(zhì)激素類藥物對(duì)人類和動(dòng)物的BLM誘導(dǎo)的肺纖維化 十分有效，而對(duì)人類IPF作用卻有限；（3)動(dòng)物肺纖維化模型中BLM誘導(dǎo)的氣管給藥和人類 的全身靜脈用藥相比，前者會(huì)改變肺纖維化的動(dòng)力學(xué)進(jìn)程；（4)人類IPF的病理過(guò)程最初起 源于肺泡上皮細(xì)胞，而BLM誘發(fā)的肺纖維化早期病變可能是由肺泡內(nèi)皮細(xì)胞的損傷而致。
[0004]此外不同給藥方式也會(huì)造成模型病理的不同，氣管給藥方法有給藥次數(shù)少、操作 較難、動(dòng)物死亡率高、急性肺損傷程度重、膠原代謝紊亂的程度輕、纖維化病灶的分布以支 氣管周圍為顯著的特點(diǎn)；腹腔或皮下給藥方法有給藥次數(shù)多、操作較容易、動(dòng)物死亡率低、 急性肺損傷程度較輕、膠原代謝紊亂的程度較重、纖維化灶的分布以胸膜下為顯著的特點(diǎn)， 此點(diǎn)可能更近似于人類的普通型肺纖維化（UIP)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了克服BLM多組分共同作用、操作較難、動(dòng)物死亡率高的缺點(diǎn)， 而提供一種操作方法簡(jiǎn)單，對(duì)模型動(dòng)物損傷較小，模型成功率高，且非常符合肺纖維化發(fā)病 過(guò)程的肺纖維化動(dòng)物模型。
[0006]血管緊張素II在制備肺纖維化動(dòng)物模型中的應(yīng)用。
[0007] -種肺纖維化動(dòng)物模型的制備方法，它包括：將7-9周齡FVB小鼠，按體重 0. 4-0. 6mg/kg，隔日皮下注射血管緊張素II，連續(xù)注射50-70天； 所述的注射劑量為按體重〇. 5mg/kg; 所述的連續(xù)注射時(shí)間為60天。
[0008] 本發(fā)明提供了一種新型肺纖維化模型，它是應(yīng)用介導(dǎo)肺纖維化發(fā)生的重要啟動(dòng)因 子作為誘導(dǎo)劑，采用血管緊張素II〇. 5mg/kg體重，隔日皮下注射2個(gè)月，成功誘導(dǎo)肺組織纖 維化，且操作方法簡(jiǎn)單，對(duì)模型動(dòng)物損傷較小，模型成功率高，建立時(shí)間比較符合肺纖維化 慢性進(jìn)展的特征，模型成型后比較穩(wěn)定，克服了博來(lái)霉素造模28天后可能出現(xiàn)的自愈情況 或早期死亡。這將對(duì)今后研究肺纖維化發(fā)病機(jī)制和靶向治療藥物提供良好的模型基礎(chǔ)，尤 其對(duì)今后在分子水平乃至基因水平層面研究肺纖維化發(fā)病機(jī)制將是個(gè)重大突破。
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1肺組織HE染色狀態(tài)圖（X40,a:對(duì)照組，b:模型組）； 圖2肺組織苦味酸天狼猩紅染色狀態(tài)圖（X40,a:對(duì)照組，b:模型組）； 圖3對(duì)照組和模型組CTGF蛋白表達(dá)對(duì)比圖； 圖4對(duì)照組和模型組PAI-1蛋白表達(dá)對(duì)比圖； 圖5對(duì)照組和模型組TNF-alpha蛋白表達(dá)對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 實(shí)施例1造模 本發(fā)明通過(guò)對(duì)FVB小鼠皮下注射血管緊張素II，誘導(dǎo)小鼠肺組織纖維化。具體造模流 程及檢測(cè)方法如下： (1) 動(dòng)物分組：將8周齡雄性FVB小鼠隨機(jī)分為2組，即對(duì)照組和模型組，每組30只； (2) 血管緊張素II造模：模型組隔日皮下注射非壓力劑量AngII0.5mg/kg體重（溶于 0. 5ml生理鹽水)，對(duì)照組皮下注射等容積生理鹽水。分別觀察15天、30天、60天后處死小 鼠，觀察肺組織變化； (3) 飼養(yǎng)條件：可為本領(lǐng)域中常規(guī)的飼養(yǎng)方法，一般在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)。所述的SPF (specific-pathogen-free)級(jí)環(huán)境為：溫度 22±2°C，，濕度 56±5%，1 周換 2-3 次墊料，控 制12h光照，12h黑暗；飼料：常規(guī)飼料；自由進(jìn)食、進(jìn)水。
[0011] (4)動(dòng)物處死及標(biāo)本制備：采用頸椎脫白法處死小鼠，開胸取肺組織，左肺置于福 爾馬林液中浸泡，行肺組織病理學(xué)檢測(cè)，右肺提取總蛋白質(zhì)及mRNA行Westernblotting檢 測(cè)及PCR檢測(cè)。
[0012] 實(shí)施例2檢測(cè) 對(duì)FVB小鼠進(jìn)行肺纖維化程度測(cè)定，包括肺組織病理、肺細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、纖維化 和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。
[0013] (1)肺組織病理：取肺組織行石蠟包埋、脫水、切片后行HE染色，觀察肺組織基本 結(jié)構(gòu)改變，采用Szapiel的方法觀察肺組織肺泡炎及肺纖維化程度，苦味酸天狼星紅染色 (Sirius-Redstaining)觀察肺組織I型-IV型膠原的表達(dá)。
[0014] (2)肺組織凋亡情況：Westernblotting檢測(cè)Caspase3蛋白表達(dá)水平；肺組織病 理切片米用凋亡檢測(cè)試劑盒Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTP nickendlabelling(TUNEL)染色觀察凋亡細(xì)胞。
[0015] (3)肺組織炎癥反應(yīng)：real-timePCR檢測(cè)肺組織TNF-α和PAI-1mRNA表達(dá)水 平。
[0016] (4)肺纖維化和氧化應(yīng)激產(chǎn)物測(cè)定：Westernblotting檢測(cè)肺組織FN、CTGF、 p47phox和3-NT蛋白表達(dá)水平。
[0017] 實(shí)施例3造模結(jié)果評(píng)定 (1) 造模成功率：模型組30只小鼠，造模后2個(gè)月時(shí)形成肺纖維化共有29只，死亡1只 (測(cè)血壓時(shí)不慎死亡)，造模成功率97% ; (2) 肺組織病理學(xué)改變：FVB小鼠被輸注了 2個(gè)月的亞作用劑量（0. 5mg/kg)的血管 緊張素II后引起了肺臟的病理改變顯著，可引起肺組織發(fā)生明顯的炎癥及纖維化反應(yīng)（圖 1)，苦味酸天狼猩紅染色法顯示的膠原纖維增多（圖2); (3) 分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果：CTGF蛋白表達(dá)增高（圖3)及PAI-1的表達(dá)增高（圖4)可證 實(shí)肺纖維化；通過(guò)PAI-1和TNF-alpha水平的增加（圖5)可以檢測(cè)肺臟的炎癥反應(yīng)明顯高 于對(duì)照組，以上檢測(cè)結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈〇. 05); (4) 應(yīng)用Angll2個(gè)月后，并未引起小鼠血壓、心率的改變(見(jiàn)表1); 表1模型組和對(duì)照組的血壓和心率
對(duì)照組和模型組小鼠的血壓和心率沒(méi)有明顯差別（P均>0. 05)。
[0018] (5 )小鼠的心臟和腎臟組織中除了有少量炎性細(xì)胞外，未見(jiàn)到明顯纖維化表現(xiàn)。
[0019] 本發(fā)明中，小鼠進(jìn)食的飼料可為本領(lǐng)域中常規(guī)的飼養(yǎng)飼料，所用試劑和原料均市 售可得。
[0020] 本發(fā)明中，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出肺纖維化形成最佳時(shí)間為2個(gè)月。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 血管緊張素II在制備肺纖維化動(dòng)物模型中的應(yīng)用。2. -種肺纖維化動(dòng)物模型的制備方法，它包括：將7-9周齡小鼠，按體重0. 4-0. 6mg/ kg，隔日皮下注射血管緊張素II，連續(xù)注射50-70天。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種肺纖維化動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于：按體重 0·5mg/kg〇4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種肺纖維化動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于：連續(xù) 注射60天。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種肺纖維化動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于：所述的小 鼠為8周齡FVB小鼠。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型肺纖維化模型，它是應(yīng)用介導(dǎo)肺纖維化發(fā)生的重要啟動(dòng)因子作為誘導(dǎo)劑，采用血管緊張素Ⅱ0.5mg/kg體重，隔日皮下注射2個(gè)月，成功誘導(dǎo)肺組織纖維化，且操作方法簡(jiǎn)單，對(duì)模型動(dòng)物損傷較小，模型成功率高，建立時(shí)間比較符合肺纖維化慢性進(jìn)展的特征，模型成型后比較穩(wěn)定，克服了博來(lái)霉素造模28天后可能出現(xiàn)的自愈情況或早期死亡。這將對(duì)今后研究肺纖維化發(fā)病機(jī)制和靶向治療藥物提供良好的模型基礎(chǔ)，尤其對(duì)今后在分子水平乃至基因水平層面研究肺纖維化發(fā)病機(jī)制將是個(gè)重大突破。
【IPC分類】A61K38/08, A01K67/02
【公開號(hào)】CN105311618
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510829662
【發(fā)明人】楊俊玲, 任錦, 趙鳳蓮, 張慶華, 郭志敏
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)
【公開日】2016年2月10日
【申請(qǐng)日】2015年11月25日