一種哺乳動物細胞懸浮培養(yǎng)制備疫苗的方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制品領域。
【背景技術】
[0002] 細胞培養(yǎng)中目前最令人振奮的進展之一是采用了微載體（Microcarrier，MC)。最 早由VanWezel所報道的這種載體，經馬薩諸塞理工學院（MIT)的研究小組廣泛工作以后 已得到改進，并擴充了應用范圍。目前國際市場已有十幾種商品MC出售。目前常用的商品 化微載體有cytodex系列、biosilon系列、solo微載體、Cultipher微載體和Fibradisk片 狀載體等，這些微載體對用于細胞培養(yǎng)來說，價格往往過于昂貴，用于大規(guī)模生產成本大， 不適合進行工業(yè)化生產。
[0003] 微囊化技術主要用于病毒疫苗和化學藥物的微膠囊化，通過微膠囊的緩釋作用， 從而提高受試動物的預防或治療效果。微囊化培養(yǎng)在疫苗研制中的應用主要有以下幾方 面。
[0004] 在口服型疫苗中的應用，利用微膠囊技術，把可口服的疫苗包裹住，制成耐酸堿可 吸收的微膠囊。使用時通過飼料或飲水讓動物攝入，經消化道吸收以后，壁材逐漸打開，芯 材（疫苗）流出刺激動物產生免疫應答。微膠囊疫苗由于壁材的緩慢釋放，疫苗對動物產 生一個長期有效刺激，機體的免疫應答效果也會十分確實、穩(wěn)定。利用這種技術用開發(fā)魚類 的緩釋疫苗非常有意義。
[0005] 在聯(lián)苗中的應用，利用微膠囊技術，把兩種疫苗微包處理后再混合制成聯(lián)苗，由于 不同疫苗壁材打開的時間各不相同，它所包含芯材（疫苗）釋放出的時間也有先后之分，利 用微膠囊技術生產的聯(lián)苗，可以大大降低因同時免疫而產生的不同疫苗之間的拮抗作用， 使機體對疫苗刺激產生一個合理的時間差，達到良好的免疫效果。
[0006] 在基因工程疫苗研究中的應用：基因工程蛋白，在動物體內降解快，一次免疫很難 起到很好的保護效果，可通過微囊化技術把蛋白進行微囊化，在不影響蛋白的抗原性的同 時，還能延緩蛋白的免疫效果，已有文獻報道微囊化乙肝表面蛋白疫苗后的免疫效果比傳 統(tǒng)工藝疫苗有較為明顯的提升，使用一次注射就能實現(xiàn)比較好的免疫效果。
[0007] 另外微膠囊化基因工程細胞，可用于制備高濃度的表達產物。微囊化培養(yǎng)雜交瘤 細胞是一種大規(guī)模生產單克隆抗體的新技術，國外已應用于生產，其主要優(yōu)點是單抗?jié)舛?商，純度商，活力商，易于純化。
[0008] 在現(xiàn)有技術中未見有微囊化哺乳動物細胞生產病毒性疫苗的報道，主要是未解決 大規(guī)模培養(yǎng)的瓶頸問題。專利申請CN101288836公開了利用一種微生物微膠囊大量制備的 方法，并具體公開了：配制海藻酸鈉溶液作為囊材，以氯化鈣溶液作為固化劑，加入對數(shù)生 長期的微生物種子液進行固化，并將包有微生物細胞的微膠囊接入發(fā)酵液中，培養(yǎng)至對數(shù) 生長末期，過濾分離微膠囊獲得產品的技術方案。然而，該技術方案使用高壓空氣和噴頭的 噴擠壓霧法，存在有產品粒徑過大的問題，且球形度和單分散性都很差，使得產品得率低， 同時制備過程比較復雜，因此極大限制了其推廣應用。
[0009] 專利申請CN103614344公開了一種應用生物反應器及片狀載體大規(guī)模擴增豬圓 環(huán)病毒2型的方法，具體公開了培養(yǎng)PK-15細胞液，在生物反應器內接種上述細胞液，加入 片狀微載體，進行細胞懸浮培養(yǎng)，所述PK-15細胞懸浮培養(yǎng)至72小時接入豬圓環(huán)病毒2型 (PCV2)，接種24小時后至240小時采用灌注工藝培養(yǎng)，將灌注培養(yǎng)工藝收集的病毒液與生 物反應器內的病毒液混合，凍融，得豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)病毒液。然而，該申請使用價格 昂貴的片狀載體，抗原生產成本較高；同時使用片狀載體后，細胞從載體上消化解離解離困 難，不能實現(xiàn)連續(xù)放大。

【發(fā)明內容】

[0010] 為解決現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明經過多次嘗試后，采用微囊化技術進行動物 細胞的培養(yǎng)，解決了細胞大規(guī)模連續(xù)放大的問題，還發(fā)現(xiàn)利用該培養(yǎng)的動物細胞來繁殖病 毒，病毒含量較高，用此病毒液來制備病毒疫苗同樣起到比較好的免疫效果。
[0011] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種哺乳動物細胞懸浮培養(yǎng)制備疫苗方法，其特征在 于，所述方法包括以下步驟：（1)利用微囊化方法制備微囊化動物細胞；(2)在細胞培養(yǎng)系 統(tǒng)中，接入所述微囊化動物細胞進行培養(yǎng)；（3)在所述細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中接入病毒進行培養(yǎng)， 收獲病毒液，制備疫苗。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中微囊化方法包括物理化學法（相分離法），物理機械法， 化學法；所述物理化學法包括單凝聚法，復凝聚法，溶劑-非溶劑法，改變溫度法，液中干燥 法；所述物理機械法包括噴霧干燥法，噴霧凝結法，空氣懸浮法；所述化學法包括界面縮聚 法和輻射交聯(lián)法。
[0013] 其中，物理化學法又稱為相分離法：物理化學法中的單凝聚法以明膠為囊材，復凝 聚法以明膠一阿拉伯膠為囊材。
[0014] 優(yōu)選地，所述步驟（1)微囊的囊材包括明膠，阿拉伯膠，海藻酸鹽，殼聚糖，蛋白類 囊材，羧甲基纖維素鈉，醋酸纖維素酞酸酯，乙基纖維素，甲基纖維素，聚酰胺，硅橡膠，聚丙 烯酸樹脂，聚乙烯醇，聚碳酯，聚氨基酸，聚乳酸，丙交酯乙交酯共聚物。
[0015] 其中，明膠，阿拉伯膠，海藻酸鹽，殼聚糖，蛋白類囊材為天然高分子囊材；羧甲基 纖維素鈉，醋酸纖維素酞酸酯，乙基纖維素，甲基纖維素為半合成高分子囊材；聚酰胺，硅橡 膠為非生物降解，不受pH影響的合成高分子囊材；聚丙烯酸樹脂，聚乙烯醇為非生物降解， 一定pH條件下溶解的囊材；聚碳酯，聚氨基酸，聚乳酸，丙交酯乙交酯共聚物為生物降解性 囊材。
[0016] 優(yōu)選地，所述細胞包括：CH0細胞、BHK21細胞、Marcl45細胞、Vero細胞、F81細胞、 豬腎傳代細胞系PK-15或IBRS-2或其它敏感豬源細胞、ST細胞、牛睪丸細胞、牛羊犬的腎細 胞、雞胚成纖維細胞、昆蟲卵巢細胞、白紋伊蚊細胞Aa2-678、小菜蛾細胞BCIRL-Px2-HNU3、 草地貪葉蛾卵巢細胞Sf21及其克隆株Sf9和粉紋夜蛾胚胎細胞BTI-Tn5-BI-4,以及所述 各種細胞的亞型細胞株及其馴化、基因工程改造型細胞株。
[0017] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中細胞培養(yǎng)系統(tǒng)包括各種細胞培養(yǎng)瓶、袋系統(tǒng)、一次性塑料 袋系統(tǒng)、生物反應器在內的各種形式和基于各種原理的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)或裝置；其中，所述生 物反應器包括攪拌式生物反應器、氣升式生物反應器、細胞懸浮或貼壁式生長生物反應器、 間歇式或流加式或連續(xù)灌注式生物反應器、wave生物反應器在內的細胞培養(yǎng)生物反應器。
[0018] 優(yōu)選地，所述步驟（3)中所述病毒包括豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病 毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒、豬偽狂犬病毒、豬偽狂犬病毒、 鴨坦布蘇病毒、禽流感病毒、雞法氏囊病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞減蛋綜合癥病毒、乙 腦病毒、狂犬病毒、口蹄疫病毒、犬瘟熱病毒和重組桿狀病毒。
[0019] 優(yōu)選地，所述步驟（1)結束后使用胰酶消化溶解微囊，并重復所述步驟（1)的細胞 包被過程，所述重復包被過程可以重復多次。
[0020] 優(yōu)選地，所述步驟（3)中所述接入病毒進行培養(yǎng)的過程為流加培養(yǎng)。
[0021] 優(yōu)選地，所述步驟（3)中制備疫苗包括使用所述培養(yǎng)的病毒液利用本領域常規(guī)方 法制備疫苗，具體地而言，包括滅活所述病毒液制備滅活疫苗，以及添加保護劑于所述病毒 液制備活疫苗。
[0022] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種哺乳動物細胞懸浮培養(yǎng)制備細胞表達產物的方 法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：（1)利用微囊化方法制備微囊化動物細胞；(2)在 細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，接入所述微囊化動物細胞進行培養(yǎng)；（3)在所述細胞培養(yǎng)系統(tǒng)使細胞進 行細胞產物表達，收獲細胞表達產物。
[0023] 優(yōu)選地，所屬的細胞表達產物包括基因重組工程蛋白、多肽片段和小分子成分。
[0024] 本發(fā)明的又一目的在于提供所述方法在制備疫苗以及細胞表達產物方面的應用。
[0025] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0026] 1、利用微囊化技術包被貼壁細胞，降低了對微載體的依賴，并且生產成本有較大 的降低；
[0027] 2、利用微囊化技術不僅可以包被動物細胞還可包被懸浮細胞，且病毒含量均有大 幅度提