如2中將甘氨酸殘基納入到聚脯氨酸上以引入鏈柔性。最終，糖肽5不僅 提供了對(duì)糖密度的作用的了解，而且還提供了對(duì)活性基序的排列的了解（圖29B和29C)。
[0165] 實(shí)施例3 :CS糖肽1-7的制備
[0166] 研究開(kāi)始于含有炔烴官能團(tuán)的生物活性CS-E和未硫酸化CS二糖單元的合成（圖 30)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，以良好的產(chǎn)率和立體選擇性將三氯乙酰亞胺酯8[4]轉(zhuǎn)化成受充分保護(hù)的二 糖9,這是由三氟甲磺酸三甲代甲硅酯所介導(dǎo)的。值得注意的是，對(duì)末端炔烴進(jìn)行保護(hù)以避 免自由基錫氫化作用 [5]。在獲得了關(guān)鍵中間體的情況下，使用脫保護(hù)-硫酸化步驟繼續(xù)研 究。使用正三丁基錫烷和AIBN使N-三氯乙?；?jīng)自由基介導(dǎo)的還原為N-乙?；愇?， 得到乙酰胺10。將苯亞甲基縮醛水解，繼而去除TMS基團(tuán)，得到二醇11。用S03 ?三甲胺復(fù) 合物對(duì)11進(jìn)行的處理高效地提供硫酸酯基序。通過(guò)用LiOOH和NaOH相繼處理成功地制成 了所需的CS-E二糖13。在類似條件下將11脫保護(hù)，得到未硫酸化的二糖12。
[0167] 由于典型的固相Fmoc化學(xué)導(dǎo)致非常低的偶合效率，因此經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)的液相肽合成 來(lái)制備所有的含有疊氮化物的聚脯氨酸衍生物。使用〇-(苯并三唑-1-基）-N，Ν，Ν'，Ν' -四 甲基脲四氟硼酸（TBTU)作為偶合試劑使受Boc保護(hù)的氨基酸與氨基酸甲酯偶合。在隨后的 偶合反應(yīng)之前，分別通過(guò)用CF3C02H/CH2CV混合物和NaOH水溶液處理來(lái)去除所得肽的Boc 和甲酯保護(hù)基。重復(fù)偶合和脫保護(hù)直到獲得所需的聚脯氨酸衍生物為止。通過(guò)二氧化硅快 速柱色譜或反相HPLC將所有肽純化到同質(zhì)并且通過(guò)質(zhì)譜分析來(lái)表征。
[0168] 在獲得了CS二糖和聚脯氨酸衍生物的情況下，接下來(lái)的重點(diǎn)在于經(jīng)由使炔烴官 能化的CS二糖與疊氮基官能化的聚脯氨酸綴合來(lái)合成含糖聚合物。在DMS0中在環(huán)境 溫度下在碘化亞銅（I)、N，N-二異丙基乙胺（DIPEA)以及三[(1-苯甲基-1H-1，2,3-三 唑-4-基）甲基]胺（TBTA)存在下在氬氣氛下將點(diǎn)擊反應(yīng)進(jìn)行7天。通過(guò)FT-IR和1HNMR 光譜法來(lái)監(jiān)測(cè)疊氮基向1，2, 3-三唑的完全轉(zhuǎn)化（參見(jiàn)圖19和圖20至26中所示的NMR譜） [6]。雖然疊氮基-聚脯氨酸的FT-IR譜揭示了在2100cm1處存在強(qiáng)振動(dòng)譜帶，這是疊氮化 物部分的特征，但是在糖肽衍生物的譜中疊氮化物譜帶的消失明確地證實(shí)了偶合反應(yīng)的完 成。此外，1HNMR譜揭示了來(lái)自CS二糖的新信號(hào)。此外，在點(diǎn)擊反應(yīng)之后在8. 2ppm處的特 征峰表明了 1，2, 3-三唑連接的形成。因此，F(xiàn)T-IR譜和1HNMR譜這兩者充分證實(shí)了用于二 糖的點(diǎn)擊反應(yīng)的效率。使所得的反應(yīng)混合物從THF/甲醇混合物中沉淀，然后轉(zhuǎn)化成它們的 鈉鹽。通過(guò)尺寸排阻色譜進(jìn)行純化，得到所需的CS糖肽1-7。
[0169] 實(shí)施例4:圓二色性研究
[0170] 在成功制備了糖肽的情況下，進(jìn)行圓二色性（CD)研究以探究所述糖肽的PPII 螺旋穩(wěn)定性。盡管一些報(bào)道已經(jīng)表明聚脯氨酸可以被高效地官能化，而保持ΡΡΠ構(gòu)象 [3b^'3d]，但是進(jìn)行嘗試以驗(yàn)證龐大的并且?guī)Ц唠姾傻膫?cè)基是否可以誘導(dǎo)主鏈的構(gòu)象變化， 從而使得難以將官能團(tuán)定位在所需的位點(diǎn)處。對(duì)于這些研究，將肽溶液（400μM)在4°C孵 育24小時(shí)以允許完全折疊并且在室溫進(jìn)行測(cè)量。為了檢測(cè)糖肽的主鏈構(gòu)象，將相應(yīng)CS二 糖的CD信號(hào)（參見(jiàn)圖27) [7]從糖肽的CD信號(hào)中減去。CD曲線（展示于圖28中）證實(shí)雖 然3的CD譜如所預(yù)期表現(xiàn)出無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象，但是其它糖肽采取聚脯氨酸II型螺旋型，在 224nm-228nm處具有最大正帶并且在208nm-213nm處具有最小負(fù)帶，如通常對(duì)于PPII螺旋 所觀測(cè)到的那樣[8]。這些數(shù)據(jù)確認(rèn)了將CS二糖納入到聚脯氨酸中沒(méi)有影響主鏈的折疊，并 且聚脯氨酸支架即使在沿螺旋的同一面存在陰離子基團(tuán)的情況下仍維持了天然的結(jié)構(gòu)。
[0171]實(shí)施例 5:ELISA
[0172] 為了評(píng)價(jià)糖肽與蛋白質(zhì)受體相互作用的能力，通過(guò)ELISA研究每一種制劑與神經(jīng) 生長(zhǎng)因子（NGF)的結(jié)合親和力，所述NGF已知選擇性地結(jié)合CS-E硫酸化基序[9]。對(duì)于這一 研究，將恒定濃度的糖肽固定在鏈霉親和素包被的96孔板上，繼而將各種濃度的NGF處理 到溶液中作為細(xì)胞表面上GAG-細(xì)胞外蛋白質(zhì)相互作用的模擬。通過(guò)與HRP綴合的多克隆 NGF抗體來(lái)測(cè)量與糖肽結(jié)合的NGF的量。糖肽1和6用作這一蛋白質(zhì)結(jié)合研究的初始化合 物。結(jié)果是NGF以濃度依賴性方式與CS-E硫酸化糖肽1結(jié)合并且沒(méi)有展示出與未硫酸化 的糖肽6有顯著的結(jié)合（圖31A)。盡管1對(duì)NGF表現(xiàn)出中等的結(jié)合親和力，但是這些結(jié)果 與先前的報(bào)道相一致，在這些報(bào)道中，CS-E硫酸化基序提供了對(duì)NGF的主要結(jié)合表位。為 了增強(qiáng)結(jié)合親和力，進(jìn)行嘗試以修飾制劑1。聚脯氨酸支架的一個(gè)預(yù)期的后果在于糖肽主鏈 的剛性將會(huì)妨礙靶蛋白質(zhì)的結(jié)合，這是因?yàn)榫酆衔镦湹娜嵝詫?duì)于通過(guò)適應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)的二 級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行相互作用來(lái)說(shuō)是重要的 [1°]。為了解決這個(gè)問(wèn)題，制備兩種化合物，這兩種化 合物含有部分柔性鏈（通過(guò)并入甘氨酸殘基）（2)或完全柔性鏈（3)。然而，與1相比，沒(méi)有 觀測(cè)到結(jié)合親和力的增強(qiáng)，這表明鏈的柔性在模型系統(tǒng)中不是關(guān)鍵性的因素（圖31B)。
[0173] 先前的研究已經(jīng)證實(shí)多價(jià)配體中結(jié)合元件的密度可以影響對(duì)靶蛋白質(zhì)的結(jié)合親 和力 [6W1]。為了探究結(jié)合表位密度的影響，合成糖肽4。在這一設(shè)計(jì)中，在與CS-E綴合 的脯氨酸之間添加脯氨酸殘基以引入更大的間距，而保持與初始制劑1相同的糖表位空間 排列。與1相比，這種修飾使得NGF結(jié)合親和力顯著提高約2. 6倍（圖31A)。值得注意的 是，相對(duì)于任何其它因素，這種現(xiàn)象通過(guò)利用剛性聚脯氨酸特性完全源于結(jié)合表位之間的 距離，而沒(méi)有干擾空間和電子環(huán)境來(lái)實(shí)現(xiàn)的。最終，所有的CS單元均被部署在一個(gè)面，而其 它兩個(gè)面含有脯氨酸殘基，這產(chǎn)生具有重復(fù)PPPE或PPPU單元的制劑5和7 (圖29B和29C)。 化合物5是最有效的NGF結(jié)合配體，與1相比，提高4. 6倍，而7沒(méi)有表現(xiàn)出任何結(jié)合（圖 31A)。因此，所述結(jié)果明確地證實(shí)多價(jià)配體中結(jié)合表位的空間排列對(duì)針對(duì)靶受體的結(jié)合親 和力具有相當(dāng)大的影響。
[0174] 實(shí)施例6:表面等離子體共振
[0175] 進(jìn)一步利用表面等離子體共振（SPR)技術(shù)來(lái)促進(jìn)對(duì)糖肽-NGF相互作用的定量實(shí) 時(shí)動(dòng)力學(xué)分析。使用H)C/NHS偶合化學(xué)以相對(duì)低的密度（約700RU)將鏈霉親和素涂在羧 基葡聚糖（carboxydextran)CM5傳感器芯片上以阻止與NGF的非特異性相互作用。然后以 根據(jù)分子量歸一化的水平[12](對(duì)于1和5,分別是104RU和127RU)，將生物素化的糖肽固定 在鏈霉親和素包被的表面上。在25°C通過(guò)以50μL·π?η1將各種濃度的NGF(llnM-185nM) 在表面上注射240秒并且持續(xù)800秒記錄解離來(lái)監(jiān)測(cè)動(dòng)力學(xué)，之后使用2. 5MMgCU容液 使表面再生。如圖32中所示，這兩種CS-E硫酸化糖肽均由NGF高效地識(shí)別。此外，與糖 肽1相比，糖肽5提供了更高的總響應(yīng)，這表明5比1更高效地募集NGF。這些結(jié)果與上文 所述的ELISA的結(jié)果相一致。使用二態(tài)結(jié)合模型進(jìn)行進(jìn)一步的動(dòng)力學(xué)分析以全面了解這 一結(jié)合事件。公知的是，許多碳水化合物-蛋白質(zhì)結(jié)合過(guò)程比簡(jiǎn)單朗繆爾（Langmuir) 1:1 相互作用要復(fù)雜得多，并且表現(xiàn)出二態(tài)結(jié)合動(dòng)力學(xué)[13]。在這個(gè)模型中，與表面結(jié)合的糖 肽與NGF結(jié)合以形成初始復(fù)合物，然后進(jìn)行構(gòu)象變化以形成更穩(wěn)定的復(fù)合物[14]。包括平 衡常數(shù)KD在內(nèi)的全部動(dòng)力學(xué)參數(shù)（其中括號(hào)中為標(biāo)準(zhǔn)誤差）給出于下表3中。這一動(dòng) 力學(xué)分析產(chǎn)生有趣的結(jié)果。KD值的比較揭示制劑5(KD= 137nM)比制劑1(KD= 2500nM) 以約18倍更強(qiáng)地與NGF結(jié)合。此外，動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明5的更高的結(jié)合親和力主要是歸 因于與l(kal⑴=1.95(±0. 39010?1^)相比，相對(duì)快速的初始締合速率（kal(5)= 4. 65 (±0. 16)X104MS4。這個(gè)結(jié)果表明結(jié)合表位陳列中的微小變化可以顯著地影響靶受 體蛋白被聚集的速率。先前的研究已經(jīng)集中在基于結(jié)合表位密度，通過(guò)改變生物活性單體 與無(wú)活性單體的比率來(lái)優(yōu)化活性 [ιαη]。在此，發(fā)現(xiàn)結(jié)合基序的簡(jiǎn)單構(gòu)象變化就足以操控受 體-配體相互作用。
[0176] 表3 :糖肽1和5對(duì)NGF的計(jì)算（二態(tài)動(dòng)力學(xué)模型）平衡結(jié)合常數(shù)
[0177]
[0178] 實(shí)施例7:用作生物模擬物的糖肽
[0179] 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用以確保適當(dāng)?shù)哪X功能的蛋白 質(zhì)家族。特別是，神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF)對(duì)于某些神經(jīng)元的存活和分化來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵的。它分布 在腦的許多部分中，如黑質(zhì)、基底前腦以及腦干。在這些部位中NGF的喪失可以導(dǎo)致神經(jīng)元 死亡以及最終的神經(jīng)變性病癥，包括帕金森氏病和阿爾茨海默氏病。為了維持神經(jīng)元的存 活和神經(jīng)突生長(zhǎng)，NGF與跨膜受體TrkA結(jié)合，誘導(dǎo)受體磷酸化并且激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 NGF與TrkA之間的相互作用需要糖胺聚糖（GAG)硫酸軟骨素，它促進(jìn)穩(wěn)定復(fù)合物的形成。 設(shè)計(jì)和合成模擬天然GAG在各種系統(tǒng)中具有結(jié)合特異性和親和力以及生物活性的糖肽。
[0180] 實(shí)驗(yàn)程序
[0181] 細(xì)胞培養(yǎng)
[0182] 將大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12)細(xì)胞在T75組織培養(yǎng)瓶中維持在含有10%熱滅活的馬 血清（HI-HS)、5%胎牛血清（FBS)以及 1 %青霉素（penicillin)/鏈霉素（streptomycin) 的完全RPMI1640生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在實(shí)驗(yàn)之前將來(lái)自液氮的儲(chǔ)備培養(yǎng)物在加濕室中在37°C 和5%C02下培養(yǎng)72小時(shí)。
[0183] 玻璃蓋玻片的制備
[0184] 將13mm玻璃蓋玻片在65%硝酸中浸泡至少三天。將蓋玻片在輕微搖動(dòng)下用蒸餾 水、70 %乙醇以及100%乙醇洗滌3次，每次30分鐘。將蓋玻片在細(xì)胞培養(yǎng)罩中在紫外線滅 菌下干燥過(guò)夜。對(duì)于涂布，向每一個(gè)蓋玻片添加60μ1的層粘連蛋白溶液（25μg/ml于無(wú) 菌PBS溶液中），繼而在37°C孵育2小時(shí)。在使用之前將蓋玻片用PBS沖洗3次，并且在培 養(yǎng)罩中干燥。
[0185] 神經(jīng)突生長(zhǎng)測(cè)定
[0186] 將PC12細(xì)胞以100個(gè)細(xì)胞/mm2的密度在含有1 %HI-HS的RPMI1640分化培養(yǎng) 基中接種在層粘連蛋白包被的蓋玻片上。在37°C使細(xì)胞貼附于表面，持續(xù)1小時(shí)。將蓋玻 片轉(zhuǎn)移到24孔板中并且將細(xì)胞與新鮮的分化培養(yǎng)基一起孵育1小時(shí)。在室溫將糖肽與NGF 在分化培養(yǎng)基中孵育1小時(shí)，之后共同添加到所述細(xì)胞中。在培養(yǎng)階段結(jié)束時(shí)，在室溫將細(xì) 胞用4%甲醛溶液固定15分鐘并且用PBS沖洗2次。將所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次并且每一次按一 式兩份進(jìn)行。對(duì)于每一種處理，對(duì)400個(gè)-500個(gè)隨機(jī)選擇的單細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過(guò)對(duì)具有 至少一個(gè)細(xì)胞體長(zhǎng)的神經(jīng)突長(zhǎng)度的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)確定帶有神經(jīng)突的細(xì)胞的百分比。
[0187] 蛋白質(zhì)印跡
[0188] 將PC12細(xì)胞以300個(gè)細(xì)胞/mm2的密度接種在層粘連蛋白包被的蓋玻片上并且每 一種處理使用一個(gè)蓋玻片（總共約40, 000個(gè)細(xì)胞）。在使用之前，使細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中 饑餓12-18小時(shí)。對(duì)于糖肽處理，在37°C將細(xì)胞與含有10μΜ糖肽的新鮮分化培養(yǎng)基一起 孵育1小時(shí)。為了誘導(dǎo)TrkA磷酸化，在37°C將細(xì)胞用4ng/ml最終濃度的NGF處理5分鐘。 將細(xì)胞用冰冷的PBS洗滌并且使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液 裂解。將蛋白質(zhì)樣品在4%-12%SDS-PAGE凝膠上分離并且轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。將膜 在室溫封閉1小時(shí)并且在4°C用抗TrkAAb(1:1500)和抗pTrkAAb(1:1500)探測(cè)過(guò)夜，繼 而與用辣根過(guò)氧化物酶綴合的二抗一起孵育2小時(shí)。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。 使用ImageJ程序?qū)l帶進(jìn)行定量并且計(jì)算磷酸化TrkA與總TrkA的比率并且以任意單位 (a.u.)表不。
[0189] 結(jié)果
[0190]PPPE12在PC12細(xì)胞中促進(jìn)NGF介導(dǎo)的神經(jīng)突生長(zhǎng)
[0191] 當(dāng)使PC12細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中暴露于NGF時(shí)，觀測(cè)到神經(jīng)突的延長(zhǎng)。與對(duì)照相 比，單面糖肽5的處理顯著地促進(jìn)了神經(jīng)突生長(zhǎng)，而其它設(shè)計(jì)，如均勻分布的糖肽1和未硫 酸化的糖肽7沒(méi)有展示出作用（圖34)。在不存在NGF的情況下，僅接受糖肽5處理的PC12 細(xì)胞保持圓形和未分化，這表明所述糖肽經(jīng)由NGF介導(dǎo)的通路起作用。在接受糖肽5處理 的樣品的情況下，帶有神經(jīng)突的細(xì)胞的百分比也大幅增加（圖35)。
[0192]PPPE12處理增強(qiáng)了TrkA磷酸化
[0193] 通過(guò)使用蛋白質(zhì)印跡監(jiān)測(cè)TrkA激活來(lái)研究糖肽5在NGF/TrkA通路中的作用。與 對(duì)照樣品相比，添加糖肽5使NGF誘導(dǎo)的TrkA磷酸化增加了約40% (圖36)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)進(jìn) 一步支持了細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)據(jù)，即單面糖肽在NGF誘導(dǎo)的PC12分化過(guò)程中可以作為神經(jīng)元促進(jìn) 劑起作用。
[0194] 糖肽5促進(jìn)穩(wěn)定的NGF/TrkA復(fù)合物的形成
[0195] 進(jìn)行蛋白質(zhì)建模研究以探究糖肽5與NGF/TrkA復(fù)合物之間的結(jié)合。根據(jù)NGF/TrkA 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，有6個(gè)堿性殘基相距10人_17A線性排列（圖37)。糖肽5提供12個(gè) 二糖單元，所述二糖單元具有硫酸酯基團(tuán)，相距9人-11A，面向同一個(gè)方向。這允許硫酸酯 基團(tuán)與堿性殘基的完美幾何契合，這使得靜電相互作用達(dá)到最大并且穩(wěn)定化NGF/TrkA復(fù) 合物。
[0196] 應(yīng)用
[0197] 綜上所述，已經(jīng)研發(fā)出一類新的CS糖肽，其中通過(guò)利用剛性聚脯氨酸支架精確控 制CS基序的取向。操控多價(jià)相互作用的能力是有意義的，這是因?yàn)楸M管具有高電荷密度， 但是各設(shè)計(jì)對(duì)靶蛋白顯示出不同的結(jié)合親和力。確切地說(shuō)，NGF對(duì)糖肽5表現(xiàn)出最高的結(jié)合 親和力，所述糖肽5所具有的所有CS-E基序均沿一個(gè)面。此外，制劑4和5比1