調(diào)控的智能型多肽水凝膠、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水凝膠的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種？冗13調(diào)控的智能型多肽水凝膠、制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]理想的組織工程材料不僅需要具備支持并連接組織的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，而且需要在調(diào)節(jié)組織發(fā)生和細(xì)胞的生理活動方面具有優(yōu)勢。目前大多數(shù)支架材料多采用生物大分子(殼聚糖，海藻酸鹽，膠原蛋白)或合成高分子(聚乙二醇)等，用以提供支撐細(xì)胞生長的微環(huán)境。但化學(xué)殘留，病源傳播及合成成本等問題限制了其深入應(yīng)用。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中的水凝膠，其制備方法通常為小分子自組裝和高分子交聯(lián)兩類。目前，小分子合成容易、成本低廉但由于其結(jié)構(gòu)為人工設(shè)計，難以實(shí)現(xiàn)降解；高分子凝膠制備簡單、結(jié)構(gòu)可控，但難以實(shí)現(xiàn)生物響應(yīng)位點(diǎn)的合理嵌入及降解。本研究，將相應(yīng)位點(diǎn)合理地嵌入進(jìn)合成方便的多肽這一小分子中，實(shí)現(xiàn)了明確的降解能力。在用于細(xì)胞培養(yǎng)的組織工程材料中，當(dāng)細(xì)胞生長到一定數(shù)量，不需要支架支撐的時候，希望組織工程材料能有效的降解，從而讓細(xì)胞更好的融入到機(jī)體組織中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種智能型多肽水凝膠及其制備方法，該水凝膠在FeCl3的作用下可坍塌為液態(tài)。
[0005]本發(fā)明的任務(wù)之一是提供水凝膠的制備方法。
[0006]—種水凝膠的制備方法，其是選用結(jié)構(gòu)式為:
[0007]NH2-VdopaVKVKVK-VDPPT-KVKVKVKV-My^多肽在 pH 為 9 ?10 的 Tris-HCl 溶液中自組裝形成的，該水凝膠在FeCl3的作用下可坍塌為液態(tài)。
[0008]上述技術(shù)方案直接帶來的有益技術(shù)效果是:第一，選用能夠使用固相合成技術(shù)方便地合成的短肽，使得合成成本低廉，純化方便；同時，設(shè)計合成的多肽采用成熟的自組裝模型，具備良好的組裝、形成水凝膠的能力；第二，在室溫條件下采用調(diào)節(jié)pH的物理方法制備水凝膠，避免了外加化學(xué)劑、紫外光等對組織造成的傷害，相比現(xiàn)有技術(shù)降低了引起組織傷害的風(fēng)險；第三，通過加入？冗13進(jìn)行降解，實(shí)現(xiàn)了通過簡單無機(jī)離子的物理作用進(jìn)行凝膠降解的功能，避免了引入化學(xué)反應(yīng)造成的潛在生物毒性和免疫源性。
[0009]作為本發(fā)明的一個優(yōu)選方案，水凝膠與FeCl3的體積比為3:1。
[0010]在Tris-HCl溶液中多肽的濃度為4mM。
[0011]本發(fā)明的另一任務(wù)是提供上述制備方法制備得到的水凝膠。
[0012]上述水凝膠為納米纖維結(jié)構(gòu)。
[0013]上述水凝膠在細(xì)胞培養(yǎng)支架中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明所帶來的有益技術(shù)效果:
[0015]本發(fā)明提供了一種水凝膠的制備方法，制備得到的水凝膠與現(xiàn)有技術(shù)最大的區(qū)別是:可在FeCl3的作用下降解；從原料的選取方面，本發(fā)明選用了多肽在Tris-HCl溶液中，控制pH為9自組裝形成，由多肽自組裝形成的納米纖維為支架，制備性質(zhì)穩(wěn)定的水凝膠，從而使其具有相應(yīng)的生物學(xué)功能，豐富了肽水凝膠形成的種類。
[0016]本發(fā)明提出的多肽分子自組裝形成的水凝膠，可通過Fe3+的加入，使其坍塌為溶液狀態(tài)，是一種Fe3+調(diào)控的智能型水凝膠，是一類較為理想的納米組織工程材料，對人類生命健康具有重要意義。
【附圖說明】
[0017]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明:
[0018]圖1是本發(fā)明通過固相合成法合成后的NH2-VdopaVKVKVK-VDPPT-KVKVKVKV-NH2g相高效液相色譜圖；
[0019]圖 2 是本發(fā)明順2-￥(1(^3￥1^1^1(-￥0??1'-1^1^1^1^-順2在 Tri s_HCl (pH7.4)溶液中自組裝原子力顯微鏡形貌圖；
[0020]圖 3 是本發(fā)明順2-￥(10口3￥1^1^1(-￥0??1'-1^1^1^1^-順2在 Tri s_HCl (pH7)溶液中自組裝透射電子顯微鏡形貌圖；
[0021]圖 4 是本發(fā)明順2-￥(1(^3￥1^1^1(-￥0??1'-1^1^1^1^-順2在 Tris-HCl (pH1)溶液中自組裝原子力顯微鏡形貌圖；
[0022]圖 5 是本發(fā)明順2-￥(1(^3￥1^1^1(-￥0??1'-1^1^1^1^-順2在 Tris-HCl (pH1)溶液中自組裝透射電子顯微鏡形貌圖；
[0023]圖6是本發(fā)明NH2-VdopaVKVKVK-VDPPT-KVKVKVKV-NH224小時后形成水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度(存儲模量和損耗模量)與頻率之間的關(guān)系；
[0024]圖7 是本發(fā)明 NH2-VdopaVKVKVK-VDPPT-KVKVKVKV-NH2形成的水凝膠加入 FeCl 3后原子力顯微鏡形貌圖；
[0025]圖8 是本發(fā)明 NH2-VdopaVKVKVK-VDPPT-KVKVKVKV-NH2形成的水凝膠加入 FeCl 3后透射電子顯微鏡形貌圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0027]首先對本發(fā)明所選用的主要實(shí)驗(yàn)儀器的規(guī)格、型號做簡要說明，下述實(shí)驗(yàn)儀器均可通過商業(yè)渠道購買獲得:
[0028]電熱恒溫孵育箱(DNP-9082型，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；
[0029]干燥消毒烤箱(DHG-9246A型，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；
[0030]紫外分光光度計(美國生物技術(shù)儀器公司);
[0031]臺式離心機(jī)(德國艾本德福公司);
[0032]原子力顯微鏡(AFM) (Nanoscope Iva型多模式原子力顯微鏡，數(shù)字儀器公司)
[0033]透射電子顯微鏡(TEM)(日本電子公司JEM1400Plus型)
[0034]流變儀(Mars III型，哈克公司)
[0035]超凈工作臺(Airtech型，江蘇安泰)
[0036]恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERACELL 150i，熱電公司，法國)
[0037]倒置顯微鏡(TS100型，尼康公司，日本)
[0038]熒光倒置顯微鏡(DMI3000B型，萊卡公司，德國)
[0039]共聚焦顯微鏡(尼康公司A1型，日本)
[0040]一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25cm2，康寧公司，costar型)
[0041 ] 一次性移液管(5mL，準(zhǔn)確度0.lmL，康寧公司，costar型)
[0042]一次性細(xì)胞培養(yǎng)板(貨號3599，康寧公司，costar型)
[0043]一次性細(xì)胞培養(yǎng)板(貨號3548，康寧公司，costar型)
[0044]液氮容器(YDS-30-125型，東亞液氮容器)
[0045]微波輔助多肽合成儀(CEM公司的Liberty 1型微波多肽自動合成儀)。
[0046]其次，本發(fā)明制備水凝膠所選用的多肽順2-￥(1(^3￥1^1^1(-￥0??1'-1^1^1^1^-順2是自制的，其具體制備方法為:
[0047]步驟1、蒸饋N, N-二甲基甲酰胺(DMF)和呢啶(Piperidine)溶劑
[0048]將購買的DMF溶液在60°C條件下減壓蒸餾，得到純的DMF溶劑；將購買的哌啶中加入少量CaH2加熱回流1-2小時，接收沸點(diǎn)溫度(106°C )的餾分，得到純的哌啶溶劑；
[0049]步驟2、氨基酸、樹脂、活化劑、蓋帽劑、去保護(hù)劑等的配制
[0050]多肽固相合成儀上計算出制備0.25mM NH2-VdopaVKVKVKVDPPTKVKVKVKV_NH2所需氨基酸和其他試劑的用量(為保證多肽合成時多肽的純度，氨基酸的用量加倍，其終濃度為 0.2M):
[0051 ] Lys (賴氨酸):1.03g 溶于 1 lmL DMF 中；
[0052]Val (異亮氨酸):2.97g 溶于 42mL DMF 中；
[0053]樹脂(載量為0.6mmol/g):0.417g ；
[0054]注意:氨基酸的a-氨基均為Fmoc保護(hù)，Lys的側(cè)鏈氨基也被保護(hù)；
[0055]活化劑:苯并三氮唑-N，N, N’，N’