單寧酸作為hiv-1潛伏感染激活劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及化合物的新應(yīng)用，特別設(shè)及單寧酸作為HIV-1潛伏感染激活劑的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] HIV-1病毒是一種感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒，它通過(guò)攻擊人體T淋己細(xì)胞， 破壞人體免疫系統(tǒng)，最終導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征艾滋病的產(chǎn)生。該病毒最初發(fā)現(xiàn)于 1981年，在此之后的Ξ十余年研究人員一直致力于對(duì)該病毒控制及清除，從而達(dá)到艾滋病 的治愈。目前的常規(guī)治療方法為簡(jiǎn)稱HAART的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，該治療方法能夠有 效的抑制病毒的復(fù)制，從而將病人外周血中的病毒載量控制到較低的水平。但是目前的通 用治療方法只能夠在一定程度上控制病毒，并不能有效的清除。究其原因是因?yàn)镠IV-1可 潛伏在細(xì)胞內(nèi)形成HIV-1儲(chǔ)藏庫(kù)，常規(guī)藥物不能影響運(yùn)些儲(chǔ)藏庫(kù)，并且病人一旦停止治療， 它們會(huì)因?yàn)楦鞣N原因被激活，從而導(dǎo)致病情反復(fù)。綜上所述，HIV-1儲(chǔ)藏庫(kù)的存在已成為 HIV-1治愈的巨大障礙，如何有效的清除HIV-1儲(chǔ)藏庫(kù)是目前HIV-1領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。 當(dāng)今的主流方法"hock and kill"是采用先激活后殺滅的思路。因此，研發(fā)安全、高效的 HIV-1潛伏感染激活劑是當(dāng)前亟待解決的問題之一。
[0003] 單寧酸（TannicAcid),結(jié)構(gòu)式為
在藥典上又稱較酸，屬于水解類單寧，水解可得到倍酸和葡萄糖，是最早研究的單寧之一，具有很強(qiáng)的生物和藥理活性，在醫(yī)藥、食品、日化等方面具有廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)有研究未公 開單寧酸具有激活HIV-1儲(chǔ)藏庫(kù)的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供單寧酸作為HIV-1潛伏感染激活劑的應(yīng)用。
[0005] 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，單寧酸具有良好的HIV-1潛伏激活能力。發(fā)明人采用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu) 建的整合了表達(dá)GFP的全長(zhǎng)HIV-1的化rkat潛伏感染的細(xì)胞模型，通過(guò)高通量篩選含有 1600種成藥的成藥庫(kù)發(fā)現(xiàn)單寧酸能夠有效地激活潛伏感染的HIV-1。進(jìn)一步用多種J-Lat 潛伏感染的細(xì)胞模型重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)單寧酸激活HIV-1潛伏感染的效果相對(duì)穩(wěn)定。下一步 我們將分別在人原代CD4+T細(xì)胞的HIV-1潛伏感染模型和病人的臨床樣本中分別驗(yàn)證單 寧酸的激活效果。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，單寧酸在化rkat細(xì)胞中的EC50為46. 63μ6,具有較好的 潛伏激活作用。單寧酸是已經(jīng)在臨床上使用的藥物，其毒性較低，安全性好，但目前尚未有 人報(bào)道其作為HIV-1潛伏感染激活劑的相關(guān)用途。本專利旨在為單寧酸作為HIV-1潛伏感 染激活劑的進(jìn)一步開發(fā)提供的強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐基礎(chǔ)，證明其具有重要的研發(fā)價(jià)值 和開發(fā)意義。
【附圖說(shuō)明】
[0006] 圖1:本實(shí)驗(yàn)室的化rkatHIV-1潛伏感染細(xì)胞系的激活效果及單寧酸在該細(xì)胞 系中對(duì)HIV-1潛伏感染的激活情況，結(jié)果顯示單寧酸在該系統(tǒng)中能夠有效地激活潛伏的 HIV-1。
[0007] 圖2:單寧酸在不同的HIV-1潛伏感染細(xì)胞系模型J-Lat8. 4及J-Lat10. 6中能 夠有效地激活HIV-1。
[0008] 圖3:使用目前常見的多種HIV-1潛伏感染的激活劑對(duì)比在它們各自在J-Lat HIV-1潛伏感染細(xì)胞系中的激活效果。
[0009] 圖4:使用目前常見的多種HIV-1潛伏感染的激活劑對(duì)比在它們各自在J-Lat HIV-1潛伏感染細(xì)胞系中的激活效果。 圖5 :單寧酸在J-LatHIV-1潛伏感染的細(xì)胞系中的EC50是46. 63μ邑。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0011] 實(shí)驗(yàn)一：化rkatHIV-1潛伏感染細(xì)胞系的構(gòu)建及單寧酸在該系統(tǒng)中的激活效果。 [001引 1.實(shí)驗(yàn)方法： 1) 取生長(zhǎng)良好的人腎上細(xì)胞株239T細(xì)胞，接種于10cm平底板中。使用的培養(yǎng)基是完 全培養(yǎng)基：高糖DMEM，10%胎牛血清W及1%雙抗，培養(yǎng)條件是5%二氧化碳、37°C; 2) 24h貼壁后，轉(zhuǎn)染抑L4-3-轉(zhuǎn)染件是培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基和VSV-G，如1)的條件繼 續(xù)培養(yǎng)； 3) 48h后，收取上清，使用陽(yáng)G-6000離屯、濃縮病毒顆粒，使用化ISAP24試劑盒檢測(cè)病 毒P24; 4) 取生長(zhǎng)良好的化rkat細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用3)中得到的病毒進(jìn)行感染，病毒用量約為10 ng/lg/到6細(xì)胞；(感染時(shí)使用促感染試劑polybrene); 5) 感染6h后換液，使用PBS清洗Ξ次，棄上清，使用1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1%雙 抗）培養(yǎng)， 6) 培養(yǎng)4-5天后，使用流式分選儀分選GFP-細(xì)胞，繼續(xù)使用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)； 7) 培養(yǎng)7天后，用TNF-;刺激分選后的細(xì)胞，濃度為10ng/ml。24h后，使用流式分選 儀分選GFP+細(xì)胞，繼續(xù)使用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)； 8) 培養(yǎng)4weeks后，用TNF-e刺激分選后的細(xì)胞，濃度為lOng/ml。24h后，使用流式分 選儀分選GFP+細(xì)胞，繼續(xù)使用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)； 9) 重復(fù)8)Ξ次，此時(shí)使用TNF-此的激活，GFP+比例大概在25%左右，化rkat潛伏 細(xì)胞模型構(gòu)建成功，并可進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化，其特點(diǎn)是該細(xì)胞模型是一個(gè)復(fù)合群，里面存在各種 HIV-1整合位點(diǎn)； 10) 取生長(zhǎng)良好的化rkat潛伏細(xì)胞鋪于96孔透明板中，每孔2透明板5細(xì)胞.分別加 入單寧酸，終濃度50加入，對(duì)照使用DMS0。使用1640培養(yǎng)； 11) 培養(yǎng)2地，離屯、收取細(xì)胞，棄上清，使用PBS清洗一次，棄上清，然后用PBS重懸； 12) 使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞的GFP表達(dá)水平，并作統(tǒng)計(jì)圖分析結(jié)果。
[0013] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。從圖中可W看出，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的HIV-1潛伏感染模型，能 夠有效的被HIV-1潛伏感染激活劑TNF-a激活。使用單寧酸處理該模型，同樣可W有效激 活HIV-1潛伏感染細(xì)胞。
[0014] 實(shí)驗(yàn)二：?jiǎn)螌幩嵩贖IV-1潛伏感染細(xì)胞模型J-Lat8. 4及J-Lat10. 6中的激活效 應(yīng) 實(shí)驗(yàn)方法： 1) 分別取生長(zhǎng)良好的J-Lat8. 4及J-Lat10. 6細(xì)胞鋪于96孔透明板中，每孔2孔明 板5細(xì)胞；分別加入單寧酸，終濃度50μ0,對(duì)照使用DMS0。使用的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基： 1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清W及1%雙抗，培養(yǎng)條件是5%二氧化碳、37°C; 2) 培養(yǎng)24h，離屯、收取細(xì)胞，棄上清，使用PBS清洗一次，棄上清，然后用PBS重懸； 3) 使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞的GFP表達(dá)水平，并作統(tǒng)計(jì)圖分析結(jié)果。
[0015] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2和3所示。從圖中可W看出，對(duì)目前多個(gè)廣泛使用的HIV-1潛伏 感染單克隆細(xì)胞模型，單寧酸同樣可W起到良好的激活作用。
[0016] 實(shí)驗(yàn)Ξ:不同的HIV-1潛伏感染激活劑在J-Lat細(xì)胞模型中的激活效果的對(duì)比 實(shí)驗(yàn)方法： 1) 取生長(zhǎng)良好的J-Lat細(xì)胞鋪于24孔透明板中，每孔6透明板5細(xì)胞。分別加入單寧 酸、SAHA、JQ1，對(duì)照使用DMS0。使用的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基：1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清W 及1%雙抗，培養(yǎng)條件是5%二氧化碳、37°C; 2) 培養(yǎng)24h，離屯、收取細(xì)胞，棄上清，使用PBS清洗一次，棄上清，然后用PBS重懸； 3) 使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞的GFP表達(dá)水平，并作統(tǒng)計(jì)圖分析結(jié)果。
[0017] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。從圖中可W看出，與其他已報(bào)道的能夠有效激活HIV-1潛 伏感染的化合物相比，單寧酸的激活效果良好。
[0018] 實(shí)驗(yàn)四：?jiǎn)螌幩嵩贘-LatHIV-1潛伏感染細(xì)胞系中的EC50 實(shí)驗(yàn)方法： 1)取生長(zhǎng)良好的J-Lat細(xì)胞鋪于96孔透明板中，細(xì)胞用量為2胞用量^孔。分別加 入不同濃度的單寧酸，終濃度分別為：320μM，160μM，80μM，40μM，20μM，10μM，5 μΜ，0μΜ： 2) 培養(yǎng)24h，離屯、收取細(xì)胞，棄上清，使用PBS清洗一次，棄上清，然后用PBS重懸； 3) 使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞的GFP表達(dá)水平，并作統(tǒng)計(jì)圖分析結(jié)果。
[0019] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可W看出，單寧酸的EC50是46. 63μΜ(由 prism軟件計(jì)算得出），具有較好的潛伏感染的激活效果。
[0020] 單寧酸的衍生物，特別是其為藥學(xué)可接受的鹽、醋，如其鋼、鐘、巧、鐵、亞鐵、鋒鹽、 乙醋、下醋等在體內(nèi)可W水解出單寧酸，因而具有與單寧酸相同或相近的活性，同樣可W激 活HIV-1潛伏感染，便于HIV的后續(xù)治療。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 單寧酸及其衍生物作為HIV-ι潛伏感染激活劑的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：?jiǎn)螌幩岬难苌餅槠渌帉W(xué)上可接受的鹽、 酯。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：?jiǎn)螌幩崴帉W(xué)上可接受的鹽為其鈉、鉀、鈣、 鐵、亞鐵、鋅鹽。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：?jiǎn)螌幩崴帉W(xué)上可接受的酯為其乙酯、丁 酯。5. -種HIV-1潛伏感染激活劑，其活性成分為單寧酸或其衍生物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的HIV-1潛伏感染激活劑，其特征在于：?jiǎn)螌幩岬难苌餅槠?藥學(xué)上可接受的鹽、酯。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的HIV-1潛伏感染激活劑，其特征在于：?jiǎn)螌幩崴帉W(xué)上可接受 的鹽為其鈉、鉀、鈣、鐵、亞鐵、鋅鹽。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的HIV-1潛伏感染激活劑，其特征在于：?jiǎn)螌幩崴帉W(xué)上可接受 的酯為其乙酯、丁酯。
【專利摘要】本發(fā)明公開了單寧酸作為HIV-1潛伏感染激活劑的應(yīng)用。運(yùn)用了整合了帶有<i>GFP</i>報(bào)告基因的HIV-1的Jurkat潛伏感染細(xì)胞系，通過(guò)高通量篩選成藥庫(kù)證實(shí)單寧酸具有激活HIV-1潛伏的作用，導(dǎo)致篩選系統(tǒng)中GFP表達(dá)量將上調(diào)。并且進(jìn)一步通過(guò)在J-Lat等多個(gè)HIV-1潛伏感染的細(xì)胞模型克隆株中的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該藥物的確存在良好的激活HIV-1潛伏的作用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，單寧酸在J-Lat細(xì)胞中的EC50為46.63μM，具有較好的HIV-1潛伏感染的激活效果，單寧酸在HIV-1潛伏感染的激活方面具有重要的研發(fā)價(jià)值和開發(fā)意義。
【IPC分類】A61K31/7024, A61P31/18
【公開號(hào)】CN105380954
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510745224
【發(fā)明人】張輝, 陳燦燦, 劉超
【申請(qǐng)人】中山大學(xué)
【公開日】2016年3月9日
【申請(qǐng)日】2015年11月3日