利用可溶性cd24治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法
【專利說明】
[0001] 本案是申請?zhí)枮?01180021423. 6,申請日為2011-4-28,題目為"利用可溶性CD24 治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法"的申請的分案。
[0002] 相關(guān)申請的交叉引用
[0003] 本申請要求與2010年4月28日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/329, 078的權(quán)益， 其內(nèi)容通過參考并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明設(shè)及用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的組合物和方法。
【背景技術(shù)】
[0005] 本章節(jié)提供背景信息，其不必是現(xiàn)有技術(shù)，而且是對本公開內(nèi)容的綜合概述，該公 開內(nèi)容不是其全部范圍或其所有特征的全面公開。
[0006]CD24被稱為耐熱抗原（1)。其表達(dá)為糖基憐脂酷肌醇（GPI)-錯定分子（2)，并且 在不同譜系中具有廣泛的分布（3)。由于CD24傾向于在未成熟細(xì)胞上表達(dá)，其也已經(jīng)被用 作部分干細(xì)胞標(biāo)記物W及用于淋己細(xì)胞分化。與CD24有關(guān)的第一功能是對抗原特異性T 細(xì)胞反應(yīng)的共刺激活性（4-6)。體內(nèi)試驗(yàn)表明，作為淋己器官中T細(xì)胞激活的共刺激因子， CD24是多余的，但是在缺乏CD28時其變成必要的（7,8)。運(yùn)并不適合并非作為"共刺激因 子富集的"的局部祀器官的情況。與運(yùn)種概念一致，我們證明了具有CD24定向突變的小鼠 完全抵抗實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE)的誘導(dǎo)巧）（10)。
[0007] 人CD24的多態(tài)現(xiàn)象與數(shù)種自身免疫性疾病的風(fēng)險和進(jìn)展相關(guān)（11-15)，包括多發(fā) 性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)。在多發(fā)性硬化癥的情況中，我們已經(jīng)報告了由鼠CD24和 人IgGlFc的胞外部分組成的可溶性CD24改善實(shí)驗(yàn)性自身免疫性疾病多發(fā)性硬化癥的鼠 模型的臨床癥狀巧）。由我們中的一員進(jìn)行的最近的研究表明，CD24與危險相關(guān)分子模式 (DAMPS)的宿主反應(yīng)相互作用并對其進(jìn)行抑制（16)。
[0008]RA影響0.5-1 %的人口數(shù)量。盡管很多緩解疾病的抗風(fēng)濕性藥物（DMA畑S)目前 可用，但是根據(jù)美國風(fēng)濕病學(xué)改善標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會，即使生物學(xué)DMARDs的金標(biāo)準(zhǔn)，即祀向腫瘤壞 死因子α的治療法在小于50%的接受該治療的患者中導(dǎo)致50%改善（ACR50) (17)。不能 達(dá)到對RA的治愈。因此，測試另外的RA治療法的必要的。RA被假定為關(guān)節(jié)中的自身免疫 性疾病，盡管該疾病的病因很大程度上仍然不明。很多研究在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理 中設(shè)及Τ細(xì)胞（18)。最近，已經(jīng)顯示，抗體轉(zhuǎn)移能引發(fā)小鼠關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)展（19-21)。損傷 病理學(xué)類似于人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0009] 從RA通過抗體的被動轉(zhuǎn)移的研究中建立的最有趣的概念之一是：即使所述抗體 無所不在被表達(dá)的蛋白質(zhì)具有特異性，也能觀察到組織特異性的自身免疫性疾病（19-21)。 運(yùn)種概念是重要的，因?yàn)槠浔砻?，盡管具有共同的發(fā)病機(jī)理，不同器官/組織的自身免疫性 疾病可能需要不同治療。支持運(yùn)種概念的是，廣泛用于治療多發(fā)性硬化癥的干擾素β對治 療RA顯示很小的效果RA(22)。
[0010] 與人RA相關(guān)的動物模型對DMARDs方面治療發(fā)展的進(jìn)展起著重要作用。例如，在 小鼠和大鼠中膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)病對開發(fā)RA治療法是關(guān)鍵的（23)。最近，已經(jīng)證實(shí)，抗膠原 抗體的適應(yīng)性轉(zhuǎn)移在小鼠中引發(fā)強(qiáng)烈的類似RA的損害（19)。因?yàn)樵诩膊“l(fā)作之前RA患者 的自身抗體增加（24, 25)，因此膠原特異性抗體的被動轉(zhuǎn)移是人類RA的相關(guān)模型。
[0011] 因?yàn)镽A的發(fā)病機(jī)理設(shè)及對DAMP的宿主反應(yīng)（26, 27)，而且因?yàn)镃D24分子負(fù)調(diào)節(jié) 對DAMP的宿主反應(yīng)（16)，因此我們研究了利用可溶性CD24治療RA的可能性。選擇RA的 被動轉(zhuǎn)移模型，原因在于其與人類疾病相關(guān)且實(shí)驗(yàn)設(shè)計簡單。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本文提供了通過向需要其的哺乳動物施用CD24蛋白質(zhì)而治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的 方法。所述CD24蛋白質(zhì)可包括成熟小鼠CD24或成熟人CD24的序列或其變體。成熟人CD24 可由沈QIDN0:1或2組成。成熟小鼠CD24可由沈QIDN0:3序列組成。所述CD24蛋白 質(zhì)還可包括小鼠或人CD24的胞外域，其可與成熟CD24的N-端融合。CD24的胞外域可由 SEQIDN0:4序列組成。所述CD24蛋白質(zhì)還可包括一部分哺乳動物免疫球蛋白（Ig)，其可 與成熟CD24的N-端或C-端融合。所述Ig部分可W是人Ig蛋白質(zhì)的Fc部分，其可W是 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或IgA。該Fc部分可由人Ig蛋白質(zhì)的較鏈區(qū)和C肥與C冊結(jié)構(gòu)域 組成。所述Fc部分還可W由人IgM的較鏈區(qū)和C冊與CH4結(jié)構(gòu)域組合。
[0013]CD24蛋白質(zhì)可W是可溶性的，而且可W是糖基化的。CD24蛋白質(zhì)可利用真核蛋白 表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)。該表達(dá)系統(tǒng)可包括包含在中國倉鼠卵巢細(xì)胞系中的載體或復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體。所述復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可穩(wěn)定地整合到真核細(xì)胞的基因組中。
[0014] 附圖簡述
[0015] 圖1.CD24融合蛋白CD24IgGlFc(沈QIDN0:5)的氨基酸組成。下劃線的26個氨 基酸是CD24的信號膚（SEQIDN0:4)。該序列的框住的黑體部分是融合蛋白中使用的成 熟CD24蛋白質(zhì)（SEQIDN0:1)。通常存在于成熟CD24蛋白質(zhì)中的末尾氨基酸（A或V)已 經(jīng)從構(gòu)建物中刪除W避免免疫原性。非下劃線的、非粗體的字母是包含較鏈區(qū)和CH1與C肥 結(jié)構(gòu)域的IgGl化序列（SEQIDN0:6)。
[0016] 圖2.純化和處理從哺乳動物細(xì)胞系表達(dá)的CD24IgGlFc的方法。
[0017] 圖3.來自小鼠的成熟CD24蛋白質(zhì)（SEQIDNO:^與來自人的成熟CD24蛋白質(zhì) (SEQIDNO:2)之間的氨基酸序列變化。潛在糖基化位點(diǎn)被加粗，其中N-糖基化位點(diǎn)為紅 色。
[0018] 圖4.CD24Ig對RA的治療效果。使8-10周齡雄性BALB/c小鼠靜脈內(nèi)免疫接種 2mg/小鼠Art虹itoMab誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎抗體雞尾酒（M抓ioproducts,StPaul,MN)。2天后，對 小鼠腹腔注射溶于PBS中的9ygLPS。利用下述評分系統(tǒng)每日監(jiān)控疾病發(fā)展。0,無反應(yīng)， 正常；1，輕微，但明確的踩/腕發(fā)紅及腫脹或者限于個別趾的表觀發(fā)紅和腫脹，而不管受侵 襲趾的數(shù)目；2,中度至嚴(yán)重的踩/腕發(fā)紅及腫脹；3,整個手爪發(fā)紅及腫脹；4,包括趾在內(nèi) 的四肢發(fā)炎最大化，設(shè)及多個關(guān)節(jié)。所顯示的數(shù)據(jù)是來自四肢的合成分?jǐn)?shù)（平均值+S巧。 沖<0. 05, *沖<0. 01，**沖<0. 001。兩組之間的差異基于費(fèi)雪化SD測驗(yàn)也是顯著的。
[0019] 圖5.CD24IgGl的藥物代謝動力學(xué)的WinNonlin區(qū)室模擬分析。開環(huán)代表3只小鼠 的平均值，線條是預(yù)期藥物代謝動力學(xué)曲線，a.靜脈注射ImgCD24IgGl。b.皮下注射Img CD24IgGl。c.比較如通過曲線下面積（AUC)、半衰期和最大血液濃度測量的抗體總量。注 意，皮下注射的全部AUC和Cmax是靜脈注射的約80%，盡管該差異不是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。
[0020] 圖6.PAMP與DAMP之間的CD24-SiglecG(10)相互作用鑒別。A.對PAMP的宿主反 應(yīng)不受CD24-SiglecG(10)相互作用的影響。B.CD24-SiglecG(10)相互作用抑制對DAMP 的宿主反應(yīng)，可能是通過SiglecG/10-結(jié)合的甜P-1。
[002。 圖7.A單次注射CD24FC降低CAIA的臨床分?jǐn)?shù)。a.試驗(yàn)圖標(biāo)。BALB/c小鼠（8周 齡）在第一天接受mAbs并結(jié)合載體或融合蛋白。在第Ξ天對小鼠注射LI^并每日觀察，連 續(xù)3周，b.CD24化降低CAIA的臨床分?jǐn)?shù)。在第一天注射一次融合蛋白（Img/小鼠）或載 體。雙盲法測定臨床分?jǐn)?shù)。*，P<0. 05 ;**，P<0. 01 ;***，P<0. 001。CD24的效果在6個獨(dú)立 試驗(yàn)中再現(xiàn)，包括PBS組總計52只小鼠W及CD24FC組總計54只小鼠。
[0022] 圖8.CD24FC降低關(guān)節(jié)中的炎性細(xì)胞因子和CAIA的水平。如在圖7a中所圖解引發(fā) 和處理CAIA。通過來自抓地armingen的細(xì)胞因子小球微陣列測量炎性細(xì)胞因子。a.代 表性FACS曲線，b.在關(guān)節(jié)勻漿中測量的減少的細(xì)胞因子（平均值+S巧的概述。
[0023] 圖9.CD24FC減少關(guān)節(jié)中的炎癥和軟骨破壞。在第屯天，從CD24FC處理小鼠和對 照小鼠中切下前爪和后爪，在4%多聚甲醒中固定24小時，之后用5%甲酸脫巧。然后將爪 埋入石蠟中并用H&E和番紅0紅（Sigma-Al化ich)染色縱切面。
[0024] 圖10.在CAIA誘導(dǎo)第五天施用的CD24FC的治療效果。將CAIA-誘導(dǎo)的小鼠隨機(jī) 分成兩組，接受載體（PB巧或CD24FC。用雙盲法為小鼠計分。顯示了代表性的Ξ個獨(dú)立試 驗(yàn)。
[002引圖11.低劑量CD24FC防止CAIA發(fā)展。a.試驗(yàn)圖，b.關(guān)節(jié)炎的臨床分?jǐn)?shù)，雙盲法 計分。
[002引 圖12.Siglecg對于CD24FC的治療效果是基本的，WT(a)和Siglecg-/-小鼠化） 接受載體對照或CD24FC并結(jié)合抗膠原mAbs的雞尾酒。雙盲法每天記錄臨床分?jǐn)?shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可溶形式的CD24對治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎非常有效。
[002引1.定義
[0029] 本文使用的術(shù)語目的僅僅是描述特定實(shí)施方式，而非意圖是限定性的。如在本說 明書和所附權(quán)利要求中所述，單數(shù)形式"一個（a,an)"和"該（the)"包括復(fù)數(shù)指代，除非上 下文另外清楚指示。
[0030] 關(guān)于本文中的數(shù)值范圍描述，具有相同精確程度的其間的每個居間的數(shù)值明確考 慮在內(nèi)。例如，對于范圍6-9,除了6和9之外，數(shù)字7和8也考慮在內(nèi)，而對于范圍6. 0-7. 0， 數(shù)值6. 0、6. 1、6. 2、6. 3、6. 4、6. 5、6.6、6. 7、6.8、6. 9 和 7. 0 明確考慮在內(nèi)。
[0031]"膚"或"多膚"是氨基酸的連接序列，并且可W是天然的、合成的，或者天然或合成 的修飾體或組合。
[0032]"基本相同的"可指第一氨基酸序列和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、 110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290 或 300 個氨基酸的區(qū)域內(nèi)至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%或99%相同。
[003引"治療（treatment或treating)"當(dāng)指防止動物免遭疾病時，意指預(yù)防、壓制、抑制 或完全消除所述疾病。預(yù)防疾病包括在疾病發(fā)作之前向動物施用本發(fā)明的組合物。壓制疾 病包括在疾病引發(fā)之前但在其臨床表現(xiàn)之前向動物施用本發(fā)明的組合物。抑制疾病包括在 疾病臨床表現(xiàn)之后向動物施用本發(fā)明的組合物。
[0034]"變體"可意指由于氨基酸的插入、缺失、或保守置換而使氨基酸序列不同但是保 留至少一種生物活性的膚或多