三棱中抗腫瘤活性組分的提取方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三棱中抗腫瘤活性組分的提取方 法，以及該活性組分在制備抗肝癌、抗肺癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 三棱為黑三棱科植物黑三棱（Sparganiumstolonierum,Buch.-Ham)的干燥塊 莖，其味苦、性平、入肝、脾經(jīng)，具有破血行氣、消積止痛等功效。目前三棱一般整個(gè)或切片炮 制入藥，缺乏必要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效研究，缺乏合理的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，難以確保臨床用 藥的有效性、安全性、可持續(xù)性?？梢?，對(duì)三棱的化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步提取和研究非常有必 要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)，采用高效液相色譜技術(shù)，從三棱中提取得到具備抗肝 癌和抗肺癌活性的活性組分，且該分離方法穩(wěn)定，重復(fù)性高，制備量大，適用于大規(guī)模工業(yè) 化生產(chǎn)需要。
[0004] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[0005] -種三棱中抗腫瘤活性組分的提取方法，該方法包括以下步驟：
[0006] (1)超低溫粉碎：取干燥的三棱為原料，進(jìn)行超微粉碎5~20min，得到超微粉；
[0007] (2)乙酸乙酯提?。涸诔⒎壑屑尤胍宜嵋阴?，乙酸乙酯的加入體積（L)為超微粉 質(zhì)量（Kg)的8~10倍，70~75°C加熱1~3小時(shí)進(jìn)行提取，離心取沉淀重復(fù)1~3次，合 并提取的上清并濃縮干燥，為粗提組分；
[0008] (3)色譜分離：
[0009] (a) -維分離：取粗提組分用40%乙醇-正己烷溶液（乙醇與正己烷按體積比4 : 6配比而成，下同理）20~60°C超聲溶解至濃度為60~100mg/ml，過(guò)膜后通過(guò)高壓制備液 相色譜進(jìn)行分離，采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱，采用A流動(dòng)相為正己烷、B流動(dòng) 相為乙醇的二元流動(dòng)相體系，進(jìn)樣量為100~150mL/針，流動(dòng)相流速為550~600mL/min， 洗脫方式為B相濃度由0 %至30 % (即0 %乙醇-正己烷溶液至30 %乙醇-正己烷溶液） 梯度洗脫50-60min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210~280nm，根據(jù)紫外吸收光譜收集10-17. 5min洗脫液 作為目的組分，經(jīng)濃縮后真空冷凍干燥，得到一維液相組分；
[0010] (b)二維分離：取一維液相組分用40%乙醇-正己烷溶液20~60°C超聲溶解至 濃度為60~100mg/ml，過(guò)膜后通過(guò)高壓制備液相色譜進(jìn)行分離，采用的色譜柱為Silica正 相硅膠色譜柱，采用A流動(dòng)相為正己烷、B流動(dòng)相為乙醇的二元流動(dòng)相體系，進(jìn)樣量為1~ 4mL/針，流動(dòng)相流速為12~16mL/min，洗脫方式為B相濃度5% (即5%乙醇-正己烷溶 液）等度洗脫25-30min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210~280nm，根據(jù)紫外吸收光譜收集13. 5-14. 5min 洗脫液作為目的組分，經(jīng)濃縮后真空冷凍干燥，得到本發(fā)明抗腫瘤活性組分。
[0011] 作為優(yōu)選，所述步驟（1)中超微粉碎時(shí)間為12min。
[0012] 作為優(yōu)選，所述步驟（2)中乙酸乙酯提取的提取溫度為72°C。
[0013] 作為優(yōu)選，所述步驟（2)中超微粉與乙酸乙酯的料液比為1 : 8。
[0014] 作為優(yōu)選，所述步驟（3) (a)中粗提組分溶解于40%乙醇-正己烷溶液的濃度為 80mg/ml〇
[0015] 作為優(yōu)選，所述步驟（3) (a) -維分離中色譜柱的直徑為150mm，柱長(zhǎng)為250mm，其 中娃球粒徑為l〇ym，孔徑為10nm。
[0016] 作為優(yōu)選，所述步驟（3) (b)二維分離中一維液相組分溶解于40%乙醇-正己烷溶 液的濃度為80mg/ml。
[0017] 作為優(yōu)選，所述步驟（3) (b)二維分離中色譜柱的直徑為20mm，柱長(zhǎng)為250mm，其中 娃球粒徑為10μm，孔徑為1 〇〇A。
[0018] 本發(fā)明進(jìn)一步提供上述提取得到的抗腫瘤活性組分在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。 該抗腫瘤活性組分作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射，與藥學(xué)上的可接受載體或賦形 劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如：片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、 懸浮液、糖漿、口腔含片、舌下含片、注射劑、軟膏劑、栓劑、吸入劑等多種劑型。
[0019] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供上述提取得到的抗腫瘤活性組分在制備抗肝癌藥物中的應(yīng) 用。該抗腫瘤活性組分作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射，與藥學(xué)上的可接受載體或 賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如：片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液 劑、懸浮液、糖漿、口腔含片、舌下含片、注射劑、軟膏劑、栓劑、吸入劑等多種劑型。
[0020] 本發(fā)明原料三棱為黑三棱科植物黑三棱的干燥塊莖，其化學(xué)成分復(fù)雜，所以本發(fā) 明先選用乙酸乙酯進(jìn)行有效組分的粗提，且乙酸乙酯為脂溶性溶劑，與其相似相溶的組分 也應(yīng)該具備進(jìn)入生物活性細(xì)胞所必需的脂溶性特性，從而具有更高的進(jìn)入細(xì)胞參與細(xì)胞內(nèi) 作用的可能性。
[0021] 其次在色譜分離的選擇上選用離線二維液相色譜技術(shù)進(jìn)行有效組分的提取，其優(yōu) 勢(shì)在于二維液相色譜不僅具有更高的峰容量，而且二維具有不同的選擇性。經(jīng)過(guò)一維簡(jiǎn)化 的組分可以在二維上根據(jù)不同的選擇性實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)分離，結(jié)構(gòu)相似的化合物可能在二維上可 達(dá)到有效分離，從而提高制備的效率和化合物純度。
[0022] 本發(fā)明利用液相色譜制備的方法成功從中藥三棱中提取分離得到純度達(dá)到98% 的天然小分子化合物，該方法工藝簡(jiǎn)單，時(shí)間周期短，試劑耗費(fèi)量小，制備量大，穩(wěn)定可控， 重復(fù)性好，實(shí)用性高，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
[0023] 現(xiàn)在藥理研究表明，三棱具有多種藥理作用并被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、婦科 如子宮肌瘤各類疾病的治療。本發(fā)明得到的天然小分子化合物性質(zhì)穩(wěn)定，通過(guò)細(xì)胞在線實(shí) 時(shí)監(jiān)測(cè)的方法觀測(cè)其在體外的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)肺癌A549細(xì)胞和肝癌Η印_g2 細(xì)胞具有抑制作用，即體外實(shí)驗(yàn)抗腫瘤作用明顯，具有良好的抗癌藥物開發(fā)潛力，為抗癌天 然藥物的開發(fā)提供了新的材料來(lái)源和理論依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1所示的是本發(fā)明三棱中抗腫瘤活性組分提取方法的一維高壓液相色譜分離 圖；
[0025] 圖2所示的是本發(fā)明三棱中抗腫瘤活性組分提取方法的二維高壓液相色譜分離 圖；
[0026] 圖3所示的是本發(fā)明得到的目的組分的HPLC驗(yàn)純圖；
[0027] 圖4所示的是本發(fā)明目的產(chǎn)物對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制作用，其中上方線為空白對(duì) 照孔、下方線為實(shí)驗(yàn)孔；
[0028] 圖5所示的是本發(fā)明目的產(chǎn)物對(duì)肝癌Hep_G2細(xì)胞的抑制作用，其中上方線為空白 對(duì)照孔、下方線為實(shí)驗(yàn)孔。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述。應(yīng)該指出，以下具體說(shuō)明都是例示 性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ) 具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
[0030] 1、原料、材料：
[0031] 三棱采摘自保定安國(guó)并經(jīng)過(guò)鑒定；A549細(xì)胞、Hep_G2細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液 病醫(yī)院提供。
[0032] 2、試劑：
[0033] 乙醇?jí)蜃蕴旖蚴斜狈教灬t(yī)化學(xué)試劑廠；分析級(jí)正己烷購(gòu)自天津康科德科技有限公 司；色譜級(jí)乙酸乙酯購(gòu)自Honeywell公司；DMS0購(gòu)自Sigma公司；F-12K培養(yǎng)基購(gòu)自Life TechnologiesCorporation;MEM培養(yǎng)基貝勾自LifeTechnologiesCorporation。
[0034] 3、儀器設(shè)備：
[0035] 分析純水由密立博純水儀生產(chǎn)；超微粉碎機(jī)購(gòu)自山東三清不銹鋼設(shè)備有限公司； 臺(tái)式冷凍離心機(jī)購(gòu)自Thermo公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀上海亞容生化儀器廠；色譜柱購(gòu)自博納艾吉爾有限公司；制備型高效液相色譜儀購(gòu) 自江蘇漢邦科技有限公司；細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀購(gòu)自艾森生物（杭州）有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱 購(gòu)自立德泰勅（上海）科學(xué)儀器有限公司。
[0036] 實(shí)施例1 :
[0037] 本實(shí)施例從三棱中提取抗腫瘤活性組分的方法，包括以下步驟：
[0038] ⑴取干燥的三棱為原料，放入超微粉碎機(jī)中進(jìn)行超微粉碎，同時(shí)粉碎全過(guò)程用4°C 的水作為超微破碎機(jī)內(nèi)部冷卻液，超微粉碎時(shí)間為12min，得到超微粉。
[0039] ⑵取上述三棱超微粉3Kg，經(jīng)過(guò)三次乙酸乙酯提取，第一次提取：3kg超微粉加入 24L乙酸乙酯，72°C提取70min，提取結(jié)束，25°C、6000rpm離心30min，分別收集上清、沉淀。 第二次提?。旱谝淮翁崛〕恋砑尤?2L乙酸乙酯，72°C提取70min，提取結(jié)束，25°C、6000rpm 離心30min，分別收集上清、沉淀。第三次提取：第二次提取沉淀加入9L乙酸乙酯，72°C提 取70min，提取結(jié)束，25°C、6000rpm離心30min，收集上清，三次上清液合并并濃縮干燥，為 粗提組分。
[0040] ⑶將干燥至恒重的粗提組分用流動(dòng)相（40 %乙醇-正己烷溶液）配制成80mg/mL 的溶液，溶解后過(guò)〇. 45μm的有機(jī)濾膜，得