Gx1修飾的陰離子脂質(zhì)體腺病毒載體及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抗癌藥物開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種GX1修飾的陰離子脂質(zhì)體腺病 毒載體及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃癌是第四個最普遍的惡性腫瘤疾病，它也是世界各地的癌癥相關(guān)死亡的第二大 原因（Ferlayetal.，2010)。在胃癌的早期和中期階段，手術(shù)切除是最常見的治療方法之 一。然而，癌癥最終復(fù)發(fā)，5年生存率僅為20~25 %(Cidonetal.，2013)。隨著腫瘤的 生長，它會侵入到周圍的組織或器官，并轉(zhuǎn)移到身體的其他部位。雖然聯(lián)合化療能使生存率 明顯超過單化療（Wagneretal.，2006)，平均存活期仍然在9到11個月不等（DeVitaet al.，2012)，總生存期仍低，5年生存率為30~36%。
[0003] 新治療方法的發(fā)展仍然是首要任務(wù)。在關(guān)于多種癌癥分子通路的理解方面，其最 近的進展引導(dǎo)了新靶向療法的發(fā)現(xiàn)。這些靶向治療策略包括表皮生長因子受體抑制劑， 抗血管生成劑，細胞周期抑制劑，細胞凋亡的啟動子和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（Ngeowet al.，2011)。一些有關(guān)細胞生長，侵襲，細胞凋亡，血管生成和轉(zhuǎn)移瘤的因子正逐漸成為許 多常見的惡性腫瘤的有希望的治療策略。腫瘤血管靶向使抗癌藥物更具選擇性，通過它 們有針對性的傳遞，從而提高治療效率，同時降低全身毒性（Changetal.，2015;Liuet al.，2015;AbdollahiandFolkman, 2010)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種GX1修飾的陰離子脂質(zhì)體腺病毒載體及其制備方法 與應(yīng)用，旨在開發(fā)一種新的、療效確切的抗癌藥物。
[0005] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種GX1修飾的陰離子脂質(zhì)體腺病毒載體的制備方法，該 方法包括以下步驟：
[0006] (l)GXl-PEG2〇00 聚合物的制備
[0007] 將熒光素標記的肽GX1和CH30-PEG2000-C00H按摩爾比1 : (1~5)加入到純凈水 中，37°C反應(yīng)2~5小時后，將反應(yīng)液提純得到修飾后的聚合物GX1-PEG2000 ;
[0008] (2)陰離子脂質(zhì)體的制備
[0009] 將磷脂、琥珀酸膽固醇單酯以及膽固醇按摩爾比5 :4 :1溶于氯仿中，減壓蒸發(fā)干 燥4~6小時，將得到的干膜在TES緩沖液中水化，然后在冰水浴條件下超聲處理lmin，得 到陰離子脂質(zhì)體AL;
[0010] (3)通過鈣誘導(dǎo)相變方法將腺病毒負載在陰離子脂質(zhì)體上，得到載有腺病毒的陰 離子脂質(zhì)體；
[0011] (4)GX1修飾的陰離子脂質(zhì)體腺病毒載體的制備
[0012] 將步驟（1)中得到的聚合物GX1-PEG2000與步驟（3)中得到的載有腺病毒的陰離 子脂質(zhì)體混合，在37°C下培養(yǎng)2小時后，得到GX1修飾的陰離子脂質(zhì)體腺病毒載體。
[0013] 優(yōu)選的，在步驟⑴中，所述熒光素標記的肽GX1 ;
[0014] 所述提純具體為：將反應(yīng)溶液用分子量為3kD截留量的超濾離心管，在轉(zhuǎn)速為 5000r/min條件下離心10分鐘，重復(fù)離心四次。
[0015] 優(yōu)選的，在步驟（2)中，所述琥珀酸膽固醇單酯的制備包括以下步驟：
[0016] A、將膽固醇和琥珀酸酐以及催化劑加入到二氯甲烷中，在65°C、氮氣保護條件 下，反應(yīng)過夜；其中，所述膽固醇、琥珀酸酐、催化劑以及二氯甲烷的摩爾體積比為2_〇1 : 4mmo1 ：lmmol:20ml;
[0017] B、將步驟A中過夜后的反應(yīng)液進行冷卻、過濾后，用蒸餾水萃取；
[0018] C、將步驟B中水萃取后的下層溶液進行蒸發(fā)除去溶劑，并在50°C條件下干燥后， 得到琥珀酸膽固醇單酯。
[0019] 優(yōu)選的，在步驟A中，所述催化劑為4-二甲氨基吡啶。
[0020] 優(yōu)選的，在步驟⑵中，所述TES緩沖液包括100mMNaCl、組氨酸2mM、2mMTES，該 TES緩沖液pH7· 4 ;
[0021] 所述超聲處理具體為：用功率為200瓦時、以5對5的超聲波進行處理。
[0022] 優(yōu)選的，在步驟⑶中，所述腺病毒為腫瘤抑制基因ΡΤΕΝ表達的缺失El、Ε3的復(fù) 制缺陷型的重組腺病毒Ad，該重組腺病毒Ad由VGTC基因技術(shù)獲得。
[0023] 優(yōu)選的，在步驟（3)中，所述鈣誘導(dǎo)相變方法具體包括以下步驟：將100mM氯化鈣 添加到陰離子脂質(zhì)體AL中，陰離子脂質(zhì)體AL的終濃度為10mM，在37°C下培養(yǎng)1小時；將培 養(yǎng)液離心，將分離出的沉淀物以腺病毒載體濃縮液和TES緩沖液渦旋10分鐘使之懸浮；將 15mMEDTA直接添加到該懸浮液中，pH值至7. 4,將該溶液渦旋10分鐘后再培養(yǎng)30分鐘后， 得到載有腺病毒的陰離子脂質(zhì)體。
[0024] 本發(fā)明進一步提供上述制備方法得到的GX1修飾的陰離子脂質(zhì)體腺病毒載體在 制備抑制癌細胞迀移、癌細胞增殖以及癌細胞血管內(nèi)皮細胞增殖的藥物方面的應(yīng)用。
[0025] 優(yōu)選的，所述癌細胞為胃癌細胞。
[0026] -種GX1的寡肽（（噬菌體肽段CGNSNPKSC/GX1)被確定為一個能夠結(jié)合到人胃腫 瘤血管的識別基序。而且，事實上，已經(jīng)證實它在體外可以抑制內(nèi)皮細胞增殖，在體內(nèi)可以 抑制新血管形成（Huetal.，2014)。Folkman的研究（Folkman，2003)表明，革E1向腫瘤血 管是一種很有前景的腫瘤成像和治療策略，因為腫瘤生長和轉(zhuǎn)移很大程度上取決于血管生 成。因此，GX1可以同時充當靶向載體和抗血管生成劑，顯示出通過靶向血管來治療人胃癌 的潛力（AbdollahiandFolkman，2010;Chenetal.，2009 ;Folkman，2003)αΡΤΕΝ基因是位 于染色體10q23. 3的一個200kb的腫瘤抑制基因。一些研究報道，PTEN基因失活是與胃癌的 發(fā)病率和疾病的進展密切相關(guān)的多進程事件。以下為可能的主要機制：首先，PTEN基因?qū)?腫瘤細胞的作用是通過拮抗磷脂酰肌醇3~激酶（PI3K)/Akt信號通路；其次，它也通過下 調(diào)粘著斑激酶活性控制細胞粘附，迀移和腫瘤浸潤；第三，它可以限制通過負調(diào)節(jié)絲裂原活 化蛋白激酶（MAPK)介導(dǎo)的信號來抑制細胞分化（Xuetal.，2014;Zaitsuetal.，2015)。
[0027] 同時，以前的研究還表明，PTEN基因具有抑制腫瘤生長，延長荷瘤小鼠存活期。因 此，在本發(fā)明中，PTEN作為抑癌基因、GX1作為靶向分子可以共同作用于胃腫瘤從而抑制 腫瘤上的增殖和轉(zhuǎn)移，這種方案是可取的（Liuetal.，2012;Lietal.，2013)。另外， 在基因靶向治療研究中尋找一種安全、高效的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是一個關(guān)鍵。以前的研究成 功地通過鈣引起的相位變化的方法將腺病毒載體包合到了陰離子脂質(zhì)體中，從而制備了Ad5和陰離子脂質(zhì)體的復(fù)合物（Ad5~AL)(Zhongetal.，2010)。這種藥物傳遞系統(tǒng)克 服了陽離子脂質(zhì)體的缺點，如毒性，低傳輸效率和組織特異性。此外，作為真核細胞膜本 身就存在的部分，陰離子脂質(zhì)體有較少的細胞毒性，低免疫原性和高水平傳導(dǎo)（Zhonget al. , 2010, 2011, 2012) 〇
[0028] 基于上述研究結(jié)果，本發(fā)明使用鈣離子融合法制備陰離子脂質(zhì)體，應(yīng)用簡單的化 學方法將GX1與PEG2000連接，并且通過SDS-PAGE電泳和熒光強度的檢測進行確認；通過 后插入法將雙功能多肽GX1連接到陰離子脂質(zhì)體上面，最終得到由GX1介導(dǎo)的藥物靶向給 藥系統(tǒng)，即GX1修飾的陰離子脂質(zhì)體腺病毒載體GXl-Ad5-AL(如圖1所示）。
[0029] 通過MTT實驗考察該給藥系統(tǒng)對細胞的增殖抑制作用，transwell實驗考察對細 胞迀移的影響，細胞攝取情況考察GX1的靶向作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GXl-Ad5-AL靶向給藥系統(tǒng) 對36〇7901和!1爪^(：細胞的增殖抑制率分別是68.36%和64.13%，均高于單獨使用6父1 或Ad5-AL;GX1-Ad5-AL對細胞迀移的抑制明顯高于GX1 -AL和Ad5-AL;激光共聚焦的結(jié)果 中，連接有GX1的藥物的攝取效果明顯更好，能夠抑制胃癌血管內(nèi)皮細胞和實體胃癌細胞 的生長。
[0030] 由此，本發(fā)明GX1能靶向胃癌血管內(nèi)皮細胞介導(dǎo)腺病毒陰離子脂質(zhì)體攜載抑癌基 因PTEN發(fā)揮腫瘤抑制作用。
[0031] 相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明藥物遞送系統(tǒng) 能顯著抑制胃癌SGC-7901細胞的迀移；并能抑制SGC-7901細胞、血管內(nèi)皮細胞的人臍靜脈 內(nèi)皮細胞的增殖，這表明它可以抑制腫瘤新生血管，防止腫瘤細胞的營養(yǎng)供應(yīng)。GXl-Ad5-AL 可能成為一種很有前途的治療腫瘤的基因傳遞系