經(jīng)生物工程改造的同種異體瓣膜的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求2014年5月27日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/003, 129的優(yōu)先權(quán)和權(quán) 益，該申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容以其整體作為參考并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開(kāi)涉及用于帶瓣靜脈中瓣膜的再細(xì)胞化的方法。通過(guò)本文公開(kāi)的方法生產(chǎn)的 瓣膜對(duì)植入、移植或接枝至血管疾病患者是有利的。
【背景技術(shù)】
[0004] 靜脈瓣是在靜脈中的膜狀褶疊，其防止通過(guò)它的血液的反向流動(dòng)。當(dāng)人站立時(shí)，血 液必須抵抗重力，從腿部靜脈向上流動(dòng)以到達(dá)心臟。身體具有位于皮下脂肪層的淺靜脈，以 及位于肌肉中且沿著骨的深靜脈。短靜脈稱(chēng)為連接靜脈，連接淺和深靜脈。深靜脈在向心 推動(dòng)血液中發(fā)揮重要的作用。深靜脈中的單向瓣膜防止血液反向流動(dòng)，且深靜脈周?chē)∪?壓縮它們，幫助迫使血液向心，正如擠壓牙膏管擠出牙膏。強(qiáng)大的小腿肌群是重要的，其強(qiáng) 有力地一步步地壓縮腿部深靜脈。深靜脈從腿部向心臟運(yùn)載90%或更多的血液。
[0005] 單向瓣膜由邊緣匯合的兩瓣（flaps)(尖（cusps)或葉（leaflets))組成。這些 瓣膜幫助靜脈將血液返回至心臟。隨著血液向心運(yùn)動(dòng)，它推動(dòng)尖像一對(duì)單向轉(zhuǎn)門(mén)（在左邊 顯示）開(kāi)啟，如果重力暫時(shí)地反向推動(dòng)血液，或者血液開(kāi)始在靜脈中倒退，立即推動(dòng)該尖閉 合，防止反向流動(dòng)（在右邊顯示）。
[0006] 淺靜脈具有與深靜脈相同類(lèi)型的瓣膜，但是他們沒(méi)有被肌肉包圍。因此，淺靜脈中 的血液不是通過(guò)肌肉的擠壓作用迫使向心，并且與深靜脈中的血液相比，它流動(dòng)的更緩慢。 在淺靜脈中流動(dòng)的大部分血液是通過(guò)深和淺靜脈間很多的連接靜脈轉(zhuǎn)移至深靜脈。連接靜 脈中的瓣膜允許血液從淺靜脈進(jìn)入深靜脈但不可反向。
[0007] 慢性靜脈功能不全（CVI)是當(dāng)腿部靜脈中的靜脈壁和/或瓣膜不能有效工作時(shí) 發(fā)生的病癥，致使血液從腿部返回至心臟困難。CVI引起血液在這些靜脈中"淤積（pool)" 或聚集，這一淤積被稱(chēng)為瘀證（stasis)。靜脈使血液從全身的器官返回至心臟。為到達(dá)心 臟，血液需要從腿部的靜脈向上流動(dòng)。小腿肌群和腳部的肌群需要一步步地的收縮以擠壓 靜脈，并推動(dòng)血液向上。靜脈包含單向瓣膜以保持血液向上流動(dòng)且不倒退。當(dāng)這些瓣膜損 壞，允許血液反向滲漏時(shí)慢性靜脈功能不全發(fā)生。瓣膜損壞由于年齡、久坐或站立或者年齡 和降低的流動(dòng)性的組合而發(fā)生。當(dāng)靜脈和瓣膜脆弱至難以使血液向上流到心臟時(shí)，靜脈中 血壓長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)升高，導(dǎo)致CVI。據(jù)估計(jì)美國(guó)中百分之四十的人口患有CVI。
[0008] 采用壓力襪結(jié)合體表手術(shù)的CVI傳統(tǒng)的治療方法似乎能提高靜脈的血液動(dòng)力；但 是24周后，潰瘍愈合率僅達(dá)65%，并且12% /年的復(fù)發(fā)率。CVI和腿部潰瘍的重建深靜脈 手術(shù)治療是有創(chuàng)的，且因此使用有限。
[0009] 由于來(lái)源于心臟的栗送作用的動(dòng)態(tài)壓力，血液通過(guò)動(dòng)脈和靜脈流動(dòng)。在封閉的循 環(huán)系統(tǒng)中，靜脈回流必須等同于心輸出量。大部分的動(dòng)態(tài)壓力在動(dòng)脈血液循環(huán)中耗散。剩 余的能量被釋放到靜脈系統(tǒng)。在正常情況下，在毛細(xì)血管靜脈端的壓力是12至18mm汞柱， 且穩(wěn)定地對(duì)動(dòng)脈壓下降4至7mm汞柱。當(dāng)仰臥時(shí)，重力壓力被中和，血液隨著該動(dòng)態(tài)壓力梯 度流動(dòng)。在仰臥位中呼吸運(yùn)動(dòng)也強(qiáng)烈影響靜脈回流，但當(dāng)依賴(lài)于肢體時(shí)影響不大。
[0010] 靜液壓力源自右心房以下血液柱的重量。血密度和重力加速度決定了靜液壓力。 靜液和重力壓力以在心房下以厘米計(jì)的垂直距離的常量乘運(yùn)算（0. 77mm汞柱/cm)表示。壓 力在直立時(shí)（坐或站立）但靜止的個(gè)體中最高。然而，測(cè)量的壓力還反應(yīng)外部因素，如肌肉 收縮。其他外部因素還通過(guò)可塌陷的（collapsible)靜脈管道改變流動(dòng)。在吸氣時(shí)，橫隔 的收縮提高腹內(nèi)和下肢的靜脈壓力。腹水和肥胖產(chǎn)生相似的壓力提高，即使是仰臥時(shí)。
[0011] 在依賴(lài)上肢（dependentupperextremity)中的壓力反應(yīng)心房和第一肋骨間的垂 直距離。在直立的受試者中，上肢靜脈在垂直方向上位于心房上部，其將塌陷（如頭部或頸 部的顱外靜脈）。因此，在心房上靜脈的結(jié)構(gòu)中的壓力，不會(huì)降低至零以下。在上肢中不常 見(jiàn)水腫和返流，即使當(dāng)靜脈瓣先天缺失。單獨(dú)的中心靜脈血栓，一般僅產(chǎn)生暫時(shí)性的、近端 的水腫。
[0012] 在有能力的靜脈瓣的幫助下，通過(guò)下肢肌肉栗的血液擠壓，完成從依賴(lài)下肢的靜 脈至心臟的血液的靜脈回流。瓣膜發(fā)揮功能以使血液的靜液柱分割成段，且防止靜脈倒流。 盡管在膝下段更多數(shù)量的瓣膜暗示其更為重要的功能，但是可通過(guò)矯正股或胭靜脈功能不 全顯著改變靜液壓力。穿透靜脈瓣防止深至淺流動(dòng)，與小腿栗的壓力/流動(dòng)的關(guān)系一致的 概念。腳部的穿透靜脈是一個(gè)例外，其雙向流動(dòng)被認(rèn)為是正常的。
[0013] 慢性靜脈功能不全（CVI)和腿部潰瘍的患者每年巨大的直接花費(fèi)構(gòu)成嚴(yán)重的醫(yī) 學(xué)和社會(huì)問(wèn)題。下肢靜脈性潰瘍的患病率在0. 1至1. 0%。采用壓力襪結(jié)合體表手術(shù)的CVI 傳統(tǒng)的治療方法似乎能提高靜脈血液動(dòng)力；但是24周后，潰瘍愈合率僅達(dá)65%，并且12% /年的復(fù)發(fā)率。
[0014] 此外，手術(shù)技術(shù)要求高，且因此在重建深靜脈的手術(shù)中使用有限。
[0015] 因此，治療患有慢性靜脈功能不全和腿部潰瘍的方法尚需改進(jìn)。本公開(kāi)提供了治 療這些疾病的替代策略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本公開(kāi)的特征在于，其中，用于脫細(xì)胞化（decellularizing)和再細(xì)胞化(rece11u1arizing)帶瓣靜脈中瓣膜的材料的方法。
[0017] 本公開(kāi)提供了在體內(nèi)生理?xiàng)l件刺激下，經(jīng)組織工程改造的人帶瓣靜脈段的瓣膜功 能的成功保留。本公開(kāi)進(jìn)一步提供了以簡(jiǎn)單的血液樣本，經(jīng)脫細(xì)胞化的人靜脈段和靜脈瓣 膜的成功再內(nèi)皮化，其中生成單層內(nèi)皮細(xì)胞。
[0018] 本公開(kāi)提供了一種靜脈中瓣膜的再細(xì)胞化的方法，該方法包括引入血液至經(jīng)脫細(xì) 胞化的靜脈的管腔，血液包括內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞，且在經(jīng)脫細(xì)胞化的靜 脈的管腔中培養(yǎng)細(xì)胞，從而再細(xì)胞化靜脈中的瓣膜。
[0019] 本公開(kāi)提供了一種帶瓣靜脈中瓣膜的再細(xì)胞化的方法，其經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜是功 能性瓣膜。在實(shí)施方案中，該方包括從有經(jīng)再細(xì)胞化靜脈中瓣膜需要的受試者獲取靜脈段； 脫細(xì)胞化帶瓣靜脈；從受試者收集血液，其中血液包括內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞祖細(xì) 胞；用收集的血液灌注經(jīng)脫細(xì)胞化的帶瓣靜脈；以及在經(jīng)脫細(xì)胞化的帶瓣靜脈中培養(yǎng)細(xì) 胞，從而再細(xì)胞化該經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈中的瓣膜。
[0020] 在實(shí)施方案中，本公開(kāi)包括一種再細(xì)胞化靜脈中瓣膜的方法，其中再細(xì)胞化恢復(fù) 經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜的能力（competence)和返流壓力的耐受性。
[0021] 本公開(kāi)提供了在有需要的受試者（經(jīng)再細(xì)胞化的帶瓣膜靜脈的受體）中，治療慢 性靜脈功能不全（CVI)、深靜脈血栓（DVT)、和/或腿部潰瘍的方法，其通過(guò)引入經(jīng)再細(xì)胞化 的靜脈的帶瓣段至受試者，其中瓣膜是經(jīng)再細(xì)胞化的，再細(xì)胞化方法包括：脫細(xì)胞化同種異 體靜脈的帶瓣段；從受試者收集血液，其中血液包括內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞； 用收集的血液灌注經(jīng)脫細(xì)胞化的帶瓣；在經(jīng)脫細(xì)胞化的帶瓣靜脈的管腔中培養(yǎng)細(xì)胞；從而 再細(xì)胞化該經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈瓣膜；以及接枝經(jīng)再細(xì)胞化的帶瓣靜脈至受試者，其治療受 試者中的CVI和/或腿部潰瘍。
[0022] 在實(shí)施方案中，血液是外周靜脈血或全血。在實(shí)施方案中，外周靜脈血或全血是通 過(guò)注射或灌注引入至經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈。該方法提供了通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基和平滑肌細(xì)胞 培養(yǎng)基的灌注培養(yǎng)細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基和平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基的灌注可以是交替的。在實(shí) 施方案中，經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜是CD31陽(yáng)性的、vWF陽(yáng)性的、平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性的、且具有 細(xì)胞核。在實(shí)施方案中，經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜具有在第一峰承受的力在或者高于〇. 8N的力學(xué) 性能。在實(shí)施方案中，經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜具有等于或小于〇. 5秒的閉合時(shí)間。
[0023] 本公開(kāi)提供了一種靜脈中瓣膜的再細(xì)胞化的方法，其通過(guò)引入內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞的群中的一種或多種至經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈的管 腔中。細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的群與經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈培養(yǎng)，從而再細(xì)胞化靜脈中的瓣膜。在 接枝到其受試者后，本公開(kāi)的經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜恢復(fù)與正常健康瓣膜相似的正常的閉合時(shí) 間（即，能力）以及耐受返流壓力。本公開(kāi)的特征在于提供了僅引入內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、 內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞祖細(xì)胞的群至經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈的管腔。
[0024] 本公開(kāi)進(jìn)一步提供了靜脈中瓣膜的再細(xì)胞化的方法，其中經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜是功 能性的。該再細(xì)胞化的方法包括的步驟包括：獲取人靜脈的帶瓣段；脫細(xì)胞化靜脈；從經(jīng)再 細(xì)胞化的瓣膜的受體收集血液；用收集的血液灌注經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈數(shù)小時(shí)（例如，約2小 時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)，或者約10-20小時(shí)）；用內(nèi)皮細(xì)胞 培養(yǎng)基灌注靜脈一天以上；以及用平滑肌培養(yǎng)基灌注靜脈一天以上；從而再細(xì)胞化經(jīng)脫細(xì) 胞化的靜脈瓣膜。在接枝到有需要的受試者后，本公開(kāi)使用血液經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜恢復(fù)與 正常健康瓣膜相似的正常的閉合時(shí)間（即能力）以及耐受返流壓力。
[0025] 本公開(kāi)提供了靜脈中瓣膜的再細(xì)胞化的方法，其中經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜是功能性 的。該再細(xì)胞化的方法包括步驟：脫細(xì)胞化從供體獲取的靜脈的帶瓣段；用收集于有治療 需要（即，有靜脈中瓣膜再細(xì)胞化需要）的受試者的血液灌注數(shù)小時(shí)（例如，約2小時(shí)、3小 時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)，或者約10-20小時(shí)）；任選地，用內(nèi)皮細(xì)胞 培養(yǎng)基灌注靜脈一天以上；以及用平滑肌培養(yǎng)基灌注靜脈一天以上；從而再細(xì)胞化經(jīng)脫細(xì) 胞化的靜脈瓣膜，其中，接枝到有需要的受試者時(shí)，再細(xì)胞化恢復(fù)經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜的能力 以及返流壓力的耐受性。
[0026] 在瓣膜再細(xì)胞化的方法中，存在或衍生自外周靜脈血或全血中的細(xì)胞群，用經(jīng)脫 細(xì)胞化的靜脈培養(yǎng)。本公開(kāi)提供細(xì)胞群是同種異體的。本公開(kāi)還提供細(xì)胞群是自體的。同 種異體和/或自體細(xì)胞群收集于或存在于外周靜脈血或全血。本公開(kāi)提供從同種異體供體 收集的外周靜脈血或全血。外周靜脈血或全血是自體的。本公開(kāi)提供用同種異體的外周靜 脈血或同種異體的全血培養(yǎng)經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈。本公開(kāi)提供用同種異體的全血培養(yǎng)經(jīng)脫細(xì) 胞化的靜脈。本公開(kāi)還提供用自體的外周靜脈血或自體的全血培養(yǎng)經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈。
[0027] 本公開(kāi)提供了經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈。用脫細(xì)胞化步驟重復(fù)不止一次（定義為"周 期"）的方法脫細(xì)胞化靜脈。靜脈脫細(xì)胞化包括2至16個(gè)周期。例如，脫細(xì)胞化方法包括 14個(gè)周期。
[0028] 本公開(kāi)的帶瓣靜脈在用包括2-16個(gè)脫細(xì)胞化周期的方法脫細(xì)胞化后，與未脫細(xì) 胞化的靜脈相比，細(xì)胞核的數(shù)量減少或無(wú)細(xì)胞核（在免疫組織化學(xué)檢測(cè)中細(xì)胞核染色減少 或陰性）。在2-16個(gè)脫細(xì)胞化周期后，靜脈的特征在于具有減少的或無(wú)人類(lèi)白細(xì)胞抗原 (HLA)I類(lèi)抗原（在免疫組織化學(xué)檢測(cè)中HLAI類(lèi)抗原染色減少或陰性），和/或具有減少 的或無(wú)HLAII類(lèi)抗原（在免疫組織化學(xué)檢測(cè)中HLAII類(lèi)抗原染色減少或陰性）。與未脫 細(xì)胞化的靜脈相比，在2-16個(gè)脫細(xì)胞化周期后，靜脈的特征在于含有的膠原蛋白和硫酸化 糖胺聚糖（GAG)降低，并且彈性蛋白提高。與未脫細(xì)胞化的靜脈相比，脫細(xì)胞化降低了經(jīng)脫 細(xì)胞化的靜脈的DNA。
[0029] 本公開(kāi)提供了在經(jīng)脫細(xì)胞化的帶瓣靜脈中瓣膜再細(xì)胞化，其中經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜 和靜脈有細(xì)胞核且為CD31陽(yáng)性的。含經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜的靜脈也為平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性 的，且在靜脈外膜（tunicaadventitia)具有梭形的平滑肌細(xì)胞。經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜和靜 脈以及還是內(nèi)皮標(biāo)志物vWF陽(yáng)性的。
[0030] 本公開(kāi)提供了通過(guò)獲得功能性的瓣膜的方法，在經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈中再細(xì)胞化瓣 膜。該功能性瓣膜具有正常的閉合時(shí)間（即能力）和耐受正常水平的返流壓力。具有正常 功能的瓣膜的正常的閉合時(shí)間，在本文也被稱(chēng)為能力，是小于或等于〇. 5秒。具有正常功能 的瓣膜耐受正常水平100mm汞柱的返流壓力，且在行走7至12步時(shí)，減少至平均約18mm汞 柱至約25mm汞柱。
[0031] 本公開(kāi)提供了經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜，在接枝至有需要的受試者后，在毛細(xì)血管靜脈 端恢復(fù)12_至18_汞柱的壓力。在其受試者中經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜恢復(fù)正常的靜液和重力 壓力，其以在心房下以厘米計(jì)的垂直距離的常量乘運(yùn)算（〇.77mm汞柱/cm)表示。接枝后， 在直立（坐或站立）但靜止時(shí)的受試者中，經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜恢復(fù)正常的最高水平的100mm 汞柱的壓力。本公開(kāi)還提供了，在模擬行走和呼吸過(guò)程中發(fā)生的壓力下深靜脈系統(tǒng)中靜脈 流通的體外功能性實(shí)驗(yàn)中，具有約100mm汞柱的靜脈返流壓力的功能性經(jīng)再細(xì)胞化的瓣 膜。
[0032] 本公開(kāi)提供了瓣膜的再細(xì)胞化，在有能力的經(jīng)再細(xì)胞化靜脈瓣的幫助下，通過(guò)下 肢肌肉栗擠壓血液，完成從依賴(lài)下肢靜脈至心臟的血液的靜脈回流。本公開(kāi)的經(jīng)再細(xì)胞化 的瓣膜發(fā)揮功能以使血液的靜液柱分割成段，且防止靜脈倒流。在膝下段，經(jīng)再細(xì)胞化的靜 脈恢復(fù)更多數(shù)量的瓣膜。瓣膜的再細(xì)胞化用于通過(guò)矯正股或胭靜脈功能不全，改善靜液壓 力改變引起的癥狀。穿透靜脈瓣膜防止深靜脈至淺靜脈流動(dòng)，且恢復(fù)小腿栗的正常壓力/ 流動(dòng)關(guān)系。
[0033] 在腳部穿透靜脈中，經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜恢復(fù)通過(guò)靜脈的血液的雙向流動(dòng)。
[0034] 本公開(kāi)進(jìn)一步提供了在有需要的受試者中，治療或改善慢性靜脈功能不全（CVI) 和/或腿部潰瘍的癥狀的方法，其包括接枝經(jīng)再細(xì)胞化的靜脈的帶瓣段至受試者。該瓣膜 再細(xì)胞化方法包括一個(gè)或多個(gè)步驟。該方法包括一個(gè)或多個(gè)步驟：獲取人同種異體股靜 脈的帶瓣段；脫細(xì)胞化股靜脈中靜脈2-16個(gè)周期；從受試者收集血液；用抗凝劑灌注經(jīng)脫 細(xì)胞化的靜脈；用收集的血液灌注經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈數(shù)小時(shí)；排出血液并使用緩沖液沖洗 靜脈；以及首先用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基灌注靜脈一天以上；然后用平滑肌培養(yǎng)基灌注靜脈一天 以上；從而再細(xì)胞化經(jīng)脫細(xì)胞化的瓣膜；其中經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜接枝至受試者治療或改善 CVI和/或腿部潰瘍。
[0035] 本公開(kāi)提供了一種再細(xì)胞化的血管的帶瓣段，其用于在有需要的受試者中，治療 或改善慢性靜脈功能不全和/或腿部潰瘍的癥狀。再細(xì)胞化血管的段通過(guò)包括以下一個(gè)或 多個(gè)步驟的方法獲得：獲取人同種異體股靜脈的帶瓣段；脫細(xì)胞化股靜脈中靜脈2-16個(gè)周 期；從受試者收集血液；用抗凝劑灌注經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈；用收集的血液灌注經(jīng)脫細(xì)胞化 的靜脈數(shù)小時(shí)；排出血液并使用緩沖液沖洗靜脈；以及首先用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基灌注靜脈一 天以上；然后用平滑肌培養(yǎng)基灌注靜脈一天以上；從而再細(xì)胞化經(jīng)脫細(xì)胞化的瓣膜；其中 經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜接枝至受試者治療或改善CVI和/或腿部潰瘍；優(yōu)選地，其中，再細(xì)胞化 血管的段通過(guò)包括上述全部步驟的方法獲得。
[0036] 本公開(kāi)提供了一種實(shí)施于瓣膜的方法，瓣膜是從身體/供體獲取或獲得的靜脈的 一段，且血液從待治療的受試者收集，其中供體和待治療的受試者不是同一個(gè)體。
[0037] 本公開(kāi)的瓣膜脫細(xì)胞化的步驟包括，在合適的去垢劑/有機(jī)磷酸酯化合物中處理 帶瓣靜脈，其包括但不限于TRITON?.和磷酸三丁酯（Tri-n-butylphosphate)以及任選地 額外包含DNA酶。
[0038] 經(jīng)脫細(xì)胞化的瓣膜是通過(guò)以?xún)?nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基灌注靜脈2-6天，接著通過(guò)以平滑肌 培養(yǎng)基灌注靜脈2-6天再細(xì)胞化的。在一個(gè)方面，經(jīng)脫細(xì)胞化的靜脈的培養(yǎng)是在體外的。
[0039] 經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜是⑶31陽(yáng)性的。該經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜還可是平滑肌肌動(dòng)蛋白 陽(yáng)性的、vWF陽(yáng)性的、和/或特征在于存在梭形平滑肌細(xì)胞。經(jīng)再細(xì)胞化的瓣膜具有在第一 峰高于0· 8N的力學(xué)性能。
[0040] 本公開(kāi)提供了使用經(jīng)再細(xì)胞化的帶瓣靜脈治療由深靜脈返流和/或靜脈高壓引 起的復(fù)發(fā)性下肢腫瘤的方法。本公開(kāi)提供了經(jīng)再細(xì)胞化的帶瓣靜脈在治