針對(duì)冠狀病毒主蛋白酶的抑制劑及Zn2+的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藥學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種針對(duì)冠狀病毒主蛋白酶的抑制劑及 Zn2+的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 貓傳染性腹膜炎病毒（felineinfectiousperitonitisvirus,FIPV)，主要在貓 科動(dòng)物間傳播，可引起貓傳染性腹膜炎（felineinfectiousperitonitis,FIP)，致死率極 高。在過(guò)去的幾十年的時(shí)間里，化ijema等人嘗試開發(fā)了減毒性FIPV病毒疫苗，但是卻沒(méi)有 成功。另外，科研人員嘗試用貓腸內(nèi)冠狀病毒（FECV)、低毒性貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV) 或亞致死性貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV)來(lái)治愈貓腹膜炎也均告失敗，其原因主要是因?yàn)?病毒疫苗在貓?bào)w內(nèi)會(huì)產(chǎn)生抗體增強(qiáng)作用（antibodyenhancementofthedisease,ADE；)和 巧死綜合癥（earlydeathsyn化ome,邸巧，反而加重了病情。目前為止，現(xiàn)有技術(shù)中并未開 發(fā)出?？卺槍?duì)FIPV冠狀病毒主蛋白酶的藥物。
[0003] 目前已知，F(xiàn)IPV是冠狀病毒亞科大家族中的一員，冠狀病毒是正鏈RNA病毒，在 目前已知的正鏈RNA病毒中，它們的基因組是最大的。按照它們的自然宿主、基因序列W 及血清型關(guān)系，冠狀病毒亞科又可W分為4個(gè)屬（genus),分別為α冠狀病毒（Alphac oronavirus)、β冠狀病毒度etacoronavirus)、丫冠狀病毒（Gammacoronavirus)和δ冠 狀病毒值eltacoronavirus)。α冠狀病毒包括貓傳染性腹膜炎病毒（felineinfectious peritonitisvirus,FIPV)等；β冠狀病毒包括鼠肝炎病毒（Murinehepatitis virus,MHV)等；丫冠狀病毒包括禽傳染性支氣管炎病毒（AvianInfectiousBronchitis Virus，AIBV)等；δ冠狀病毒包括豬冠狀病毒HKU15(PorcinecoronavirusHKU15)等。
[0004] FIPV冠狀病毒基因組編碼了兩個(gè)復(fù)制多蛋白（r巧licasepolyproteins) ppla(486kDa)和ppl油(790kDa)，而它們只有在病毒編碼的蛋白酶切割成獨(dú)立亞基之后 才能使病毒完成正常轉(zhuǎn)錄、復(fù)制功能，F(xiàn)IPV冠狀病毒主要蛋白酶（簡(jiǎn)稱主蛋白酶，main protease)在運(yùn)個(gè)過(guò)程中起主要作用。如果能夠抑制FIPV冠狀病毒主蛋白酶的水解作用， 那么將會(huì)有效地抑制FIPV冠狀病毒對(duì)貓科動(dòng)物的侵染，因此，F(xiàn)IPV冠狀病毒主蛋白酶是抗 FIPV感染的理想祀標(biāo)。 陽(yáng)0化]中國(guó)專利CN1763002A公開了一種冠狀病毒主蛋白酶的邁克爾加成抑制劑N3,該 化合物的結(jié)構(gòu)通式為：
[0006]
[0007] 實(shí)驗(yàn)證明，該化合物能夠抑制FIPV冠狀病毒主蛋白酶的活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種針對(duì)冠狀病毒主蛋白酶的抑制劑及化 2+的 應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案是：
[0010] 本發(fā)明的針對(duì)冠狀病毒主蛋白酶的抑制劑，抑制劑為包括化2+和邁克爾加成抑制 劑N3的協(xié)同雙抑制劑。
[0011] 本發(fā)明還可W采用W下技術(shù)措施：
[0012] 化2+是非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制劑。 陽(yáng)01引本發(fā)明的Zn2巧FIPV冠狀病毒主蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用。
[0014] 化2+和邁克爾加成抑制劑N3的制成協(xié)同雙抑制劑。
[0015] 化2+抑制FIPV冠狀病毒主蛋白酶活性的Ki值為1. 848μΜ。
[0016] 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：
[0017] 本發(fā)明的針對(duì)冠狀病毒主蛋白酶的抑制劑及化2+的應(yīng)用中，利用化 2+針對(duì)冠狀病 毒主蛋白酶制備抑制劑，該抑制劑為化2+和邁克爾加成抑制劑共同作用的協(xié)同雙抑制劑， 其能夠顯著提高對(duì)FIPV冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性。
【附圖說(shuō)明】
[00化]圖1是為不同化合物對(duì)FIPVMPm的抑制作用示意圖；
[0019] 圖2是Zn2+的動(dòng)力學(xué)常數(shù)α Ki示意圖；
[0020] 圖3是Zn2+的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Ki示意圖；
[0021] 圖4是本發(fā)明的針對(duì)冠狀病毒主蛋白酶制備抑制劑的方法中FIPVMPm-N3-化2+復(fù) 合物的Ξ維空間結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] W下通過(guò)附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明：
[0023] 本發(fā)明的針對(duì)冠狀病毒主蛋白酶的抑制劑，抑制劑為包括化2+和邁克爾加成抑制 劑N3的協(xié)同雙抑制劑。
[0024] 化2+是非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制劑。 陽(yáng)02引本發(fā)明的Zn2巧FIPV冠狀病毒主蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用。
[0026]Zn2嘴邁克爾加成抑制劑N3的制成協(xié)同雙抑制劑。
[0027] 化2+抑制FIPV冠狀病毒主蛋白酶活性的Ki值為1. 848μM。
[0028] 對(duì)FIPV冠狀病毒主蛋白酶的表達(dá)、純化和抑制活性測(cè)定包括W下步驟：
[0029] (l)FIPV主蛋白酶基因由金唯智生物科技有限公司全合成，全合成基因所在載體 為PES;
[0030](2)將全基因合成含有FIPV主蛋白酶基因的載體陽(yáng)S轉(zhuǎn)化到大腸桿菌D冊(cè)α感受 態(tài)細(xì)胞，并涂在LB平板（含lOOmg/L氨節(jié)青霉素）上，培養(yǎng)過(guò)夜；
[00川 做從平板上挑取多個(gè)單克隆，分別接種于裝有約5mL的LB的試管（該LB溶液中 加入氨節(jié)青霉素，使其終濃度為lOOmg/L)中，培養(yǎng)過(guò)夜。然后用質(zhì)粒小題試劑盒（TIANprep MiniPlasmidKit)提取質(zhì)粒，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)粒檢測(cè)，回收條帶正確的。提取好 的含有FIPV主蛋白酶片段的載體用BamHI與XhoI酶切，然后用瓊脂糖凝膠回收900bp 左右的目標(biāo)基因片段；
[0032] (4)將目標(biāo)載體PGEX-6P-1用BamHI與化0I酶切，然后用瓊脂糖凝膠回收酶切 的片段；
[0033] (5)將（3)和（4)獲得的片段連接（將酶切回收后的基因片段和目標(biāo)載體片段按 照摩爾比5:1~10:1的比率混合在16°C下連接10-1她）轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞， 涂在LB平板（含lOOmg/L氨節(jié)青霉素）上培養(yǎng)過(guò)夜。將篩選得到的陽(yáng)性克隆，用于鑒定和 測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，F(xiàn)IPV冠狀病毒主蛋白酶的編碼基因已被正確地克隆到PGEX-6P-1載 體中；
[0034] (6)將得到的含有編碼FIPV冠狀病毒主蛋白酶基因的PGEX-6P-1載體轉(zhuǎn)化大腸桿 菌化21觸3)的菌株，并用LB平板（含lOOmg/L氨節(jié)青霉素）篩選陽(yáng)性克?。?br>[0035] (7)在化）中所述的LB平板上挑取陽(yáng)性克?。ㄔ诤邪惫?jié)青霉