一種治療游離脂肪酸致毛囊細(xì)胞凋亡的中藥組合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于傳統(tǒng)草藥的未確定結(jié)構(gòu)的藥物制劑領(lǐng)域，具體是一種治療游離脂肪酸 致毛囊細(xì)胞調(diào)亡的中藥組合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 毛囊是一個(gè)經(jīng)歷生長期、退行期和休止期周期性生長的微小器官結(jié)構(gòu)，毛囊從生 長期到休止期是W毛囊上皮周期變化部分高度協(xié)調(diào)的細(xì)胞調(diào)亡為特征的程序性器官退化 與再生的生理過程。在生長期，毛囊的上皮和真皮部分增殖分化，上皮部分向真皮延伸，形 成毛母質(zhì)、內(nèi)根銷、毛乳頭和毛干。進(jìn)入退行期，毛母質(zhì)向上運(yùn)動(dòng)，與不斷縮小的毛乳頭分 離。在休止期毛囊內(nèi)毛母質(zhì)消失，毛乳頭濃縮成球點(diǎn)狀，至到下一周期開始。細(xì)胞調(diào)亡是毛 囊發(fā)育和周期性變化的重要特征，因此有可能通過影響毛囊內(nèi)部角質(zhì)形成細(xì)胞增值和調(diào)亡 的精密調(diào)控來改變毛囊形態(tài)發(fā)生和毛囊周期循環(huán)。由于生長期毛囊毛母質(zhì)細(xì)胞有較高的增 值率，故在此周期性生長的過程中對許多生長因子、細(xì)胞因子、激素、藥物等多種體內(nèi)外因 素高度敏感。盡管近年來研究已闡明了毛囊誘導(dǎo)和早期形態(tài)發(fā)生的分子機(jī)制，但對于毛囊 生長周期的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
[0003] 毛發(fā)的生長發(fā)育依賴于毛囊，而毛囊的生長發(fā)育則需要毛囊內(nèi)外各種細(xì)胞共同維 持。毛囊內(nèi)含有不同種類的細(xì)胞，如毛乳頭細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞、毛囊角航 干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，其中毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞、毛囊角航干細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞等在毛囊生 長發(fā)育中起主要作用。毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有自我復(fù)制、自我更新、增殖、定向分化 等能力的成體干細(xì)胞。在正常條件下，體內(nèi)的干細(xì)胞處于相對靜止的狀態(tài)，當(dāng)受到損傷和藥 物的影響時(shí)，干細(xì)胞進(jìn)入分化狀態(tài)，進(jìn)而修復(fù)受損的細(xì)胞或組織。毛囊干細(xì)胞下行遷移可分 化為毛囊和毛發(fā)的各種上皮類群的細(xì)胞，促進(jìn)毛囊形成，形成新毛發(fā)；而向上遷移則分化為 皮脂腺及表皮細(xì)胞。
[0004] 人參是一種名貴中藥，在古代被稱為黃精、地精、神草，認(rèn)為其具有起死回生之效。 人參具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)氣益肺、復(fù)脈固脫、回陽救逆等功效。鹿茸含有比人參更豐富的氨基 酸、卵憐脂、維生素和微量元素等。已經(jīng)有研究證明鹿茸具有抗氧化、抗衰老作用。但人參 和鹿茸的功能還遠(yuǎn)沒開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明就是為了提供一種新的治療毛囊細(xì)胞調(diào)亡的藥物，同時(shí)挖掘人參和鹿茸未 報(bào)道的藥效功能，所提出的一種治療游離脂肪酸致毛囊細(xì)胞調(diào)亡的中藥組合物及其制備方 法。
[0006] 本發(fā)明是按照W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0007] 一種治療游離脂肪酸致毛囊細(xì)胞調(diào)亡的中藥組合物，包括人參提取液和鹿茸提取 液。
[0008] 一種上述中藥組合物的制備方法，包括W下步驟：分別稱取人參1份、鹿茸3. 5份， 加入70%酒精，室溫浸泡后分別萃取，然后按照人參提取液與鹿茸提取液的體積比為3:7 的比例混合，混合后去醇。
[0009] 所述毛囊細(xì)胞為毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞、毛乳頭細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、毛囊角航干細(xì)胞、 毛囊成纖維細(xì)胞、或表皮細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明獲得了如下的有益效果。
[0011] 本發(fā)明提供一種新的治療毛囊細(xì)胞調(diào)亡的中藥組合物。本發(fā)明的中藥組合物，可 達(dá)到在游離脂肪酸（FFA)引起毛囊細(xì)胞調(diào)亡后，使用生物學(xué)治療方式提高毛囊間充質(zhì)干細(xì) 胞增殖、分化的速率和效果，促進(jìn)毛囊形成，形成新毛發(fā)的目的，具有廣闊的應(yīng)用前景和臨 床意義。
【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞PCNA細(xì)胞增殖抗原表達(dá)圖；
[0013] 圖2是本發(fā)明毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞Ki67細(xì)胞增殖抗原表達(dá)圖；
[0014] 圖3是倒置光學(xué)顯微鏡觀察10μmol/L游離脂肪酸處理后毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞損傷 的形態(tài)變化圖；
[0015] 圖4是倒置光學(xué)顯微鏡觀察10μmol/L游離脂肪酸及本發(fā)明中藥組合物處理后毛 囊間充質(zhì)干細(xì)胞損傷的形態(tài)變化圖；
[0016] 圖5是倒置光學(xué)顯微鏡觀察50μmol/L游離脂肪酸及本發(fā)明中藥組合物處理后毛 囊間充質(zhì)干細(xì)胞損傷的形態(tài)變化圖；
[0017] 圖6是倒置光學(xué)顯微鏡觀察100μmol/L游離脂肪酸及本發(fā)明中藥組合物處理后 毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞損傷的形態(tài)變化圖；
[0018] 圖7是倒置光學(xué)顯微鏡觀察200μmol/L游離脂肪酸及本發(fā)明中藥組合物處理后 毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞損傷的形態(tài)變化圖；
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0020] 1.試劑
[0021] RPMI1640為GENMED公司的產(chǎn)品，其產(chǎn)品編號為GMS12049. 2A; 陽02引人AB血漿購自北京紅十字血液中屯、；
[0023] 人參提取物為西安源森生物科技有限公司的產(chǎn)品；鹿茸購自吉春制藥。
[0024] 2.實(shí)驗(yàn)方法 陽0巧]2. 1毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞提取與鑒定
[00%] (1)人毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞的提?。弘S機(jī)拔取毛發(fā)數(shù)根，PBS溶液沖洗；無菌的眼科 剪截取毛囊根部組織，用無菌的眼科綴子將其夾入孔板，小屯、添加RPMI1640加10%人AB血漿生長培養(yǎng)基，放入解箱，37°C、5%C〇2條件下培養(yǎng)。每天鏡下觀察，7-10天見成纖維樣 細(xì)胞爬出，帶長滿后傳代。
[0027]似人毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：待細(xì)胞長至70 %~80 %鋪滿瓶底時(shí)，WPBS液 (約3血，下同）置換培養(yǎng)基，0. 25%膜酶消化，室溫下，200化pm離屯、10分鐘，去上清。W RPMI1640加10%人AB血漿生長培養(yǎng)基3ml吹散細(xì)胞，W2XΙΟ6個(gè)細(xì)胞分種在75cm2培養(yǎng) 瓶中，2-3天換一次RPMI1640加10%人AB血漿生長培養(yǎng)基。
[0028] (3)流式細(xì)胞儀檢查鑒定毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物：檢測培養(yǎng)第3代的毛囊 間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞核中細(xì)胞增殖抗原的表達(dá)，即PCNA和Ki67細(xì)胞增殖抗原的表達(dá)（如圖 1、2所示）。
[0029] 2. 2本發(fā)明中藥組合物對游離脂肪酸致毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響
[0030] (1)實(shí)驗(yàn)分組：對照組（經(jīng)FFA10μmol/L處理，未加人參與鹿茸提取液聯(lián)合制 劑）；游離脂肪酸10μmol/L及本發(fā)明中藥組合物處理后毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞；游離脂肪酸 50μmol/L及本發(fā)明中藥組合物處理后毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞；游離脂肪酸100μmol/L及本發(fā) 明中藥組合物處理后毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞；游離脂肪酸200μmol/L及本發(fā)明中藥組合物處 理后毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0031] (2)人毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞的提取按照實(shí)驗(yàn)方法2. 1所述步驟進(jìn)行。 陽0巧做將毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞數(shù)為2X104個(gè)/孔，培養(yǎng) 基為RPMI1640加10%人AB血漿。 陽〇3引 （4)待細(xì)胞長至70%~80%鋪滿瓶底時(shí)，WPBS溶液（約3mL，下同）置換培養(yǎng) 基，分別置于l〇、50、100、200ymol/L游離脂肪酸中換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，各組再加入本發(fā)明 中藥組合物（Img/ml) 200μL培養(yǎng)9化后，倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞損傷的形態(tài)變化。
[0034] 結(jié)果如圖3-7所示，表明本發(fā)明中藥組合物促進(jìn)了游離脂肪酸處理后毛囊間充質(zhì) 干細(xì)胞的增殖。
[0035] 2. 3本發(fā)明中藥組合物對游離脂肪酸致毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)亡的影響
[0036] (1)將毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞數(shù)為2X104個(gè)/孔，培養(yǎng) 基為RPMI1640加10%人ΑΒ血漿。待細(xì)胞長至70%~80%鋪滿瓶底時(shí)，用消化液化25% 膜酶+0. 02%邸TA)在37°C下完全消化，稀釋成單細(xì)胞懸液，吸取消化液于5mL離屯、管， 4°C，20001·/min離屯、lOmin，吸去上清液。
[0037] 似用含10%人AB血漿的RPMI1640培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液，W每孔IX104個(gè) 細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul。 陽0測 做待細(xì)胞長至70%~80%鋪滿瓶底時(shí)，WPBS液（約3mL，下同）置換培養(yǎng)基， 分別置于1〇、50、100、200μmol/L游離脂肪酸中換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，各組再加入本發(fā)明中 藥組合物（Img/ml)200μL培養(yǎng)96h。 W39] (4)更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)9化后，每孔加MTT溶液巧mg/ml用PBS配制，pH= 7. 4)20ul，繼續(xù)解育地。 W40] 妨終止培養(yǎng)，小屯、吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMS0,振蕩lOmin，使結(jié)晶 物充分融解。
[0041] (6)在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，波長為490nm，記錄結(jié)果，W時(shí)間為 橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。
[0042] 結(jié)果表明，本發(fā)明中藥組合物顯著降低游離脂肪酸對毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞的調(diào)亡率 (表1)。MTT檢測結(jié)果表明：與對照組相比，不同濃度游離脂肪酸（10、50、100、200μπιο1/ L)處理后加入本發(fā)明中藥組合物，毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖率分別為48. 7%，34. 4%， 23. 1%，16. 71%。
[0043] 表1本發(fā)明中藥組合物（處理96h)對不同濃度游離脂肪酸處理后的毛囊間充質(zhì) 干細(xì)胞調(diào)亡的影響
[0044]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種治療游離脂肪酸致毛囊細(xì)胞凋亡的中藥組合物，其特征在于：包括人參提取液 和鹿茸提取液。2. -種權(quán)利要求1所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于：包括以下步驟： 分別稱取人參1份、鹿茸3. 5份，加入70%酒精，室溫浸泡后分別萃取，然后按照人參提 取液與鹿茸提取液的體積比為3 : 7的比例混合，混合后去醇。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療游離脂肪酸致毛囊細(xì)胞凋亡的中藥組合物，其特征 在于：所述毛囊細(xì)胞為毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞、毛乳頭細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、毛囊角朊干細(xì)胞、毛囊 成纖維細(xì)胞、或表皮細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種治療游離脂肪酸致毛囊細(xì)胞凋亡的中藥組合物及其制備方法，屬于傳統(tǒng)草藥的未確定結(jié)構(gòu)的藥物制劑領(lǐng)域。本發(fā)明所述的中藥組合物包括人參提取液和鹿茸提取液。本發(fā)明提供一種新的治療毛囊細(xì)胞凋亡的中藥組合物，同時(shí)，挖掘了人參和鹿茸新的藥效功能。本發(fā)明的中藥組合物，可達(dá)到在游離脂肪酸引起毛囊細(xì)胞凋亡后，使用生物學(xué)治療方式提高毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化的速率和效果，促進(jìn)毛囊形成，形成新毛發(fā)的目的，具有廣闊的應(yīng)用前景和臨床意義。
【IPC分類】A61P17/00, A61K36/258, A61K35/32
【公開號】CN105412188
【申請?zhí)枴緾N201510851694
【發(fā)明人】劉 英
【申請人】吉林省寶滬生物科技有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年11月30日