一種納米羥基磷灰石表面接枝rgd肽的制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種納米羥基磷灰石表面接枝RGD肽的制備方法與應(yīng)用，屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，我國(guó)因疾病或者創(chuàng)傷引起的骨不連、骨缺損等，達(dá)到了數(shù)百萬例，這些骨不連和骨缺損的治療均需要使用骨植入材料。目前，臨床上應(yīng)用最多的還是自體骨、異體骨以及骨植入材料。自體骨具有良好的骨傳導(dǎo)性和成骨能力，且由于是自體骨，不存在傳染病的風(fēng)險(xiǎn)，是目前骨缺損移植的金標(biāo)準(zhǔn)。但是自體骨也存在著一定的缺陷，如:會(huì)造成取骨部位的畸形，增加了患者的創(chuàng)傷面和痛苦。異體骨不存在增加患者創(chuàng)傷面的問題，但是由于異體骨與患者本身的骨會(huì)存在免疫排斥反應(yīng)，與患者本身的骨存在相容性的問題，會(huì)影響骨缺損的修復(fù)效果，且骨缺損移植一般會(huì)暴露骨髓，若異體骨中存在某種未知疾病，會(huì)使患者患上疾病，增加了患者的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。此外異體骨的來源較為有限，且成本較高，在臨床上應(yīng)用也受到了限制。因此，目前來說，應(yīng)用較多的還是以骨移植材料為主，以為骨移植材料相對(duì)于自體骨和異體骨來說，原料廣泛，成本較低，與患者不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。納米羥基磷灰石(HA)就是目前臨床上應(yīng)用較多的骨移植材料，HA是人體骨骼和牙齒的主要的無機(jī)成分，與骨組織具有良好的生物相容性，骨傳導(dǎo)性，是公認(rèn)的骨修復(fù)材料。但是羥基磷灰石與其他的骨移植材料都存在這一個(gè)共性的問題，那就是這些材料住具有骨引導(dǎo)活性，而缺乏骨誘導(dǎo)活性，因而在臨床上不能獲得令人滿意的治療效果。
[0003]精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)短肽是最小的氨基酸序列，能與整合素蛋白進(jìn)行特異性的結(jié)合，從而有效的促進(jìn)細(xì)胞在材料上的粘附，從而會(huì)影響細(xì)胞的增殖、分化等行為，提高材料的生物活性。因此，將RGD肽接枝到納米輕基磷灰石上面能夠有效的改善納米羥基磷灰石的生物活性和骨誘導(dǎo)活性。本發(fā)明所有反應(yīng)均在常溫下進(jìn)行，反應(yīng)條件較為簡(jiǎn)單，可適用于大規(guī)模的生產(chǎn)，應(yīng)用前景廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種納米羥基磷灰石表面接枝RGD肽的制備方法與應(yīng)用。該制備方法得到的納米羥基磷灰石接枝RGD改善了納米羥基磷灰石骨誘導(dǎo)活性差的問題，提高了納米羥基磷灰石的生物活性。該方法工藝簡(jiǎn)單，操作方便，反應(yīng)周期短，且得到的材料具有良好的細(xì)胞和組織相容性，特別適用于組織工程和骨缺損修復(fù)方面的應(yīng)用。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種納米輕基磷灰石表面接枝RGD肽的制備方法，步驟如下:
(1)硅烷偶聯(lián)劑在乙醇水溶液中充分水解0.5~2h，加入納米羥基磷灰石反應(yīng)6-8h，反應(yīng)完成后離心回收固體物質(zhì)，真空干燥后進(jìn)行研磨、過篩，得到表面修飾了-NH2的納米羥基磷灰石；
(2)將表面修飾了-NH2的納米羥基磷灰石與濃度為0.lmol/L的二醛水溶液混合均勻，反應(yīng)8-10h，反應(yīng)完成后離心回收固體物質(zhì)，真空干燥后研磨過篩，得到表面醛基化的納米羥基磷灰石；
(3)配制濃度為0.lmol/L的RGD肽的水溶液，將表面醛基化的納米羥基磷灰石加入到RGD肽的稀溶液中，反應(yīng)4-6h，將反應(yīng)后的產(chǎn)物離心、去離子水洗滌，然后冷凍干燥，研磨后即得到羥基磷灰石接枝RGD肽材料。
[0006]所述步驟(1)中的硅烷偶聯(lián)劑為3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷中的一種。
[0007]所述步驟(1)中納米羥基磷灰石與硅烷偶聯(lián)劑的摩爾比為1:1-1:1.5。
[0008]所述步驟(2)中的二醛為戊二醛、己二醛、1，4_ 丁二醛中的一種。
[0009]所述步驟(2)中表面修飾了 _順2的納米羥基磷灰石與二醛的摩爾比為1:1-1:1.5o
[0010]所述步驟(3)中醛基化的納米羥基磷灰石與RGD肽的摩爾比為1:1-1:1.5 ; 所述的納米羥基磷灰石接枝RGD肽在組織工程和骨修復(fù)中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明制備的納米羥基磷灰石表面接枝RGD肽的優(yōu)點(diǎn)在于:1.本發(fā)明制備的納米羥基磷灰石接枝RGD提高了納米羥基磷灰石的骨誘導(dǎo)性和生物活性；2.本發(fā)明中制備的納米羥基磷灰石表面接枝R⑶肽，后處理簡(jiǎn)單，且不會(huì)殘留有機(jī)溶劑，生物相容性良好。3.本發(fā)明所使用的方法較為簡(jiǎn)單，且都是在常溫下進(jìn)行，反應(yīng)周期短，制備效率較高，有利于工業(yè)化的生產(chǎn)。4.本發(fā)明所制備的納米羥基磷灰石接枝RGD肽增加了納米羥基磷灰石的生物活性，改善了納米羥基磷灰石骨誘導(dǎo)活性差的問題。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1
本實(shí)施例的納米輕基磷灰石表面接枝RGD肽的制備方法，步驟如下:
(1)將0.0lmol 3-氨丙基三乙氧基硅烷溶于250mL乙醇水的混合溶液中，充分進(jìn)行水解0.5h，然后將0.0lmol羥基磷灰石加入到混合溶液中，反應(yīng)6h，然后將反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行離心分離，50°C干燥12h，將干燥后的產(chǎn)物用乙醇進(jìn)行洗滌，然后再將洗滌后的產(chǎn)物進(jìn)行真空干燥(含水量<20ppm)，得到表面修飾了 -NH2的羥基磷灰石；
(2)配制100ml0.lmol/L的戊二醛水溶液，然后將0.0lmol氨基化的納米羥基磷灰石加入到戊二醛水溶液中，磁力攪拌8h，離心，去離子水洗滌，乙醇洗滌，真空干燥得到表面含有醛基的羥基磷灰石；
(3)配制lOOmL0.lmol/L的RGD肽水溶液，然后將0.0lmol的醛基化的納米羥基磷灰石加入到RGD肽水溶液中，反應(yīng)4h，將反應(yīng)后的產(chǎn)物離心、去離子水洗滌，然后冷凍干燥，研磨后即得到羥基磷灰石接枝RGD肽材料。
[0013]實(shí)施例2
本實(shí)施例的納米輕基磷灰石表面接枝RGD肽的制備方法，步驟如下:
(1)將0.015mol 3-氨丙基三乙氧基硅烷溶于375mL乙醇水的混合溶液中，充分進(jìn)行水解2h，然后將0.0lmol羥基磷灰石加入到混合溶液中，反應(yīng)7h，然后將反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行離心分離，50°C干燥12h，將干燥后的產(chǎn)物用乙醇進(jìn)行洗滌，然后再將洗滌后的產(chǎn)物進(jìn)行真空干燥(含水量<20ppm)，得到表面修飾了 -NH2的羥基磷灰石； (2)配制150ml0.lmol/L的戊二醛水溶液，然后將0.0lmol氨基化的納米羥基磷灰石加入到己二醛水溶液中，磁力攪拌9h，離心，去離子水洗滌，乙醇洗滌，真空干燥得到表面含有醛基的羥基磷灰石；
(3)配制150mL0.lmol/L的RGD肽水溶液，然后將0.0lmol的醛基化的納米羥基磷灰石加入到RGD肽水溶液中，反應(yīng)4h，將反應(yīng)后的產(chǎn)物離心、去離子水洗滌，然后冷凍干燥，研磨后即得到羥基磷灰石接枝RGD肽材料。
[0014]實(shí)施例3
本實(shí)施例的納米輕基磷灰石表面接枝RGD肽的制備方法，步驟如下:
(1)將0.012mol 3-氨丙基三甲氧基硅烷溶于250mL乙醇水的混合溶液中，充分進(jìn)行水解lh，然后將0.0lmol羥基磷灰石加入到混合溶液中，反應(yīng)8h，然后將反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行離心分離，50°C干燥12