傳統(tǒng)礦化膠原支架(TMC)的制備方法:
[0058](1) I型膠原的提取與自組裝同實(shí)施例1中步驟(1)
[0059](2)模擬體液(SBF 液)制備 SBF 溶液的制備:將 NaCl、NaHC03、KC1、Κ2ΗΡ04.3H20、MgCl2.6Η20,0β012,Νβ2804,Τγ?3依次加入1L的去離子水中，用濃度為1M的HC1調(diào)節(jié)pH值為 7.25-7.4。
[0060](3)TMC支架的制備
[0061]將(1)中制備而得的膠原從透析袋中取出，去離子水超聲清洗后置于盛有(2)中制備而得的SBF溶液的容器中，37°C的條件下放置24或72小時。取出后用去離子水清洗，然后放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，從而制備得傳統(tǒng)礦化膠原支架。
[0062](4)支架消毒方法同實(shí)施例1中步驟(4)
[0063]將實(shí)施例1、對比例1以及對比例2分別制備BMC、TMC、NMC支架材料進(jìn)行骨缺損組骨組織再生作用的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
[0064]1、BMC、TMC 和 NMC 的表征。
[0065]1)掃描電鏡(Scanning Electron Microscope, SEM)觀察支架材料表面微觀形貌。
[0066]樣品經(jīng)冷凍干燥后噴金進(jìn)行掃描電鏡觀察，比較各組樣品表面形貌的差異。結(jié)果如圖2中a, b, Co
[0067]2)透射電鏡(Transmiss1n Electron Microscope, TEM)觀察支架材料內(nèi)部微觀形貌。
[0068]樣品凍干后超薄切片于金網(wǎng)上，用TEM來表征其內(nèi)部形貌。NMC支架使用醋酸鈾負(fù)染后進(jìn)行觀察，BMC與TMC支架不染色。并用儀器附帶的原位電子衍射功能判斷無機(jī)物是結(jié)晶狀態(tài)還是無定形狀態(tài)。結(jié)果如圖2中d，e，f所示。
[0069]3)X射線衍射(X-ray diffract1n, XRD)定性確定支架材料無機(jī)礦物質(zhì)(主要為Ca、P)含量。
[0070]通過XRD技術(shù)定性分析膠原支架的礦化程度。通過不同元素對應(yīng)的峰強(qiáng)度值用軟件Origin.8.0作圖。樣本在測試前在真空干燥箱內(nèi)干燥24小時。結(jié)果如圖3所示。
[0071]2、支架材料機(jī)械性能的對比
[0072]三種支架材料干燥狀態(tài)下楊氏模量測定
[0073]將凍干后的材料裁剪成長度(mm) X寬度(mm) X厚度(mm)為5X5X2的相同大小，在干燥或者濕潤(置于PBS中浸泡30min)于拉力測試儀((3367，Instron, USA)下以10mm/min速度進(jìn)行檢測，用以評估材料的楊氏模量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。
[0074]3、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(體外實(shí)驗(yàn))
[0075]1)小鼠前成骨細(xì)胞接種支架材料后細(xì)胞增殖水平測定
[0076]將小鼠前成骨細(xì)胞(3T3-E1)接種于Go60消毒后的支架材料上，分別于3、5、7天進(jìn)行CCK-8試劑盒檢測，結(jié)果如圖5所示。
[0077]2)小鼠前成骨細(xì)胞接種支架材料后成骨分化水平測定
[0078]將小鼠前成骨細(xì)胞(3T3-E1)接種于Go60消毒后的支架材料上，分別于3、5、7天進(jìn)行ALP試劑盒檢測，結(jié)果如圖5所示。
[0079]3)小鼠前成骨細(xì)胞接種材料后死活細(xì)胞染色
[0080]將小鼠前成骨細(xì)胞(3T3-E1)接種于Go60消毒后的支架材料上，于3后天進(jìn)行A0/EB染色后于激光共聚焦下觀察細(xì)胞形態(tài)及死活細(xì)胞的分布。結(jié)果如圖6所示。
[0081 ] 4、動物實(shí)驗(yàn)(體內(nèi)實(shí)驗(yàn))
[0082]1)建造SD大鼠顱蓋骨缺損模型
[0083]將8周齡250g雄性大鼠頭部皮膚備皮，消毒，切開，用環(huán)鉆取直徑為5mm的貫通性缺損。如圖7所示。
[0084]2)不同支架材料修復(fù)大鼠顱蓋骨缺損
[0085]將不同的消毒后的支架材料置于缺損中，逐層縫合。
[0086]3)不同時間段三種材料修復(fù)的煩蓋骨微計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro ComputedTomography，Micro-CT)對比新骨生成情況
[0087]將各組大鼠分別于4周、8周進(jìn)行處死后頭蓋骨微計(jì)算機(jī)斷層掃描以研究新骨形成情況。結(jié)果如圖8所示。
[0088]4)不同時間段三種材料修復(fù)的顱蓋骨免疫組化染色分析
[0089]將各組大鼠分別于4周、8周進(jìn)行處死后頭蓋骨病理切片，然后進(jìn)行HE(圖9)和Masson 染色(圖 10)。
[0090]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0091]如圖2所示，SEM可見，支架材料中膠原纖維縱橫交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，未礦化膠原纖維(NMC)較為纖細(xì)；傳統(tǒng)礦化膠原纖維(TMC)直徑明顯增大，表面無橫紋結(jié)構(gòu)，b圖中尚可見未礦化完全的膠原纖維，以及由于礦化后硬度增加而出現(xiàn)的纖維斷裂口 ；本發(fā)明所制備仿生礦化膠原(BMC)支架中可見明顯的(D = 67nm)橫紋結(jié)構(gòu)。TEM可見，負(fù)染后的未礦化膠原纖維(NMC)自主裝完成，纖維中形成明顯的橫紋結(jié)構(gòu)；傳統(tǒng)礦化方法(TMC)由于形成的羥基磷灰石晶體較大無法進(jìn)入膠原孔隙區(qū)而沉積于膠原纖維外部；本發(fā)明所述方法，可先形成粒徑較小的(50nm左右)無定型磷酸鈣(CMC/ACP)，進(jìn)而進(jìn)入膠原纖維孔隙區(qū)及纖維之間在纖維內(nèi)形成明顯的橫紋結(jié)構(gòu)。
[0092]如圖3所示，XRD特征峰結(jié)果可見，礦化初期傳統(tǒng)礦化方法形成了大量的羥基磷灰石故而無法完成膠原纖維內(nèi)部的礦化，而本發(fā)明所述方法在相同條件下無機(jī)礦物質(zhì)大多數(shù)屬于無定型狀態(tài)，即CMC/ACP狀態(tài)。
[0093]如圖4所示，在干燥和濕潤狀態(tài)下，BMC支架的楊氏模量均高于TMC高于NMC，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0094]如圖5所示，CCK-8結(jié)果顯示，BMC支架可以顯著促進(jìn)3T3-E1的增殖；ALP結(jié)果顯示，在接種初期，TMC支架ALP表達(dá)較高，但在3天之后(包括3天)，BMC支架中細(xì)胞ALP表達(dá)更高。
[0095]如圖6所示，3T3-E1接種3天后，在BMC支架數(shù)量較多，形態(tài)較好；TMC支架次之；NMC支架細(xì)胞數(shù)量較少，分布成團(tuán)聚樣。
[0096]如圖8、9、10所示，8周時BMC組明顯新生骨量明顯多于其余組，12周時BMC已基本完全修復(fù)。新骨形成量中，BMC支架組最多，且新骨大部分沿著缺損邊緣生長，中心部少量成骨，8周時，僅可見少量未降解材料，HE染色可見毛細(xì)血管、紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及成骨細(xì)胞，12周時缺損區(qū)完全修復(fù)。TMC支架，4周時可見部分為降解材料，8周時未降解材料少見。12周時，缺損未完全修復(fù)，缺口較小。NMC支架，4周時少見未降解材料，新骨形成較少，8周時無未降解材料，新骨形成速度慢，12周時，缺損未完全修復(fù)，缺口較大?？梢夿MC支架組，新骨形成量大，大部分沿著缺損區(qū)邊緣生長，局部可見新生骨島，組織間還可見淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、毛細(xì)血管及成骨細(xì)胞。
[0097]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架，其特征在于:包括I型膠原纖維以及由羧甲基殼聚糖穩(wěn)定的無定型磷酸鈣復(fù)合物，以I型膠原纖維為支架結(jié)構(gòu)，并利用羧甲基殼聚糖使其實(shí)現(xiàn)內(nèi)外協(xié)同礦化。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架，其特征在于:所述I性膠原纖維為I型鼠尾膠原。3.一種制備根據(jù)權(quán)利要求所述1或2的纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架的方法，其特征在于:包括如下步驟， 1)I型膠原纖維的提取與自組裝； 2)仿生礦化液的制備:將1?3mM的Κ2ΗΡ04在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5?1.5%的羧甲基殼聚糖穩(wěn)定下與3?5mM的CaCl2相混合，靜置1?3小時； 3)纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架的制備:將步驟1)制備的膠原纖維從透析袋中取出，去離子水超聲清洗后，置于羧甲基殼聚糖溶液中，30?45°C的條件下放置50?90小時；取出后用去離子水超聲清洗，放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架的制備方法，其特征在于:步驟1)中的I型膠原纖維的提取與自組裝包括如下步驟， A)將新鮮6?10周齡SD大鼠鼠尾浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65?85%乙醇溶液中10?20分鐘； B)取出后去除鼠尾皮膚，提取鼠尾腱，將提取的鼠尾腱置于Tris-HCl-NaCl緩沖溶液中，在1?7°C環(huán)境下浸泡20?28小時； C)鼠尾腱取出后用去離子水沖洗，置于0.2?0.4M的醋酸溶液中，在室溫下持續(xù)攪拌2?4天，得到膠原的醋酸溶液； D)將步驟C)得到膠原的醋酸溶液在0?4°C，2000?4000r/min的條件下離心20?40分鐘后取上清，放入透析袋中； E)將透析袋置于0.015?0.025M的磷酸氫二鉀溶液中透析5-7天，完成膠原的自組裝過程。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架的制備方法，其特征在于:所述步驟E)中，磷酸氫二鉀溶液的濃度為0.02M。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架的制備方法，其特征在于:所述步驟2)中，1(2即04的濃度為2mM，羧甲基殼聚糖的濃度為1%，CaCl 2的濃度為4mM。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架的制備方法，其特征在于:所述步驟3)中，膠原纖維置于羧甲基殼聚糖溶液后，在37°C的條件下放置72小時。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架在骨組織修復(fù)中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求3?7任一項(xiàng)所述的纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架的制備方法制備的膠原支架在骨組織修復(fù)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種纖維內(nèi)外協(xié)同礦化膠原支架及其制備方法。該支架材料不僅在化學(xué)組成成分上接近天然骨組織，而且在形成過程上盡可能的模擬了天然骨組織的發(fā)生過程，從而在膠原纖維內(nèi)形成了特征性周期性的(D＝67nm)橫位結(jié)構(gòu)。這種新型的仿生礦化支架材料在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(動物實(shí)驗(yàn))、體外實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞的增殖、成骨分化)及機(jī)械性能實(shí)驗(yàn)中均較傳統(tǒng)礦化方法得來的支架材料有著明顯的優(yōu)越性，為今后臨床骨組織缺損的修復(fù)提供了新的可能性，具有更為廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61L27/12, A61L27/24, A61L27/58, A61L27/20
【公開號】CN105412987
【申請?zhí)枴緾N201510933344
【發(fā)明人】張旭, 王瑤, 王浩榮, 李長義
【申請人】天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月14日