骨移植物成骨潛能的增強(qiáng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及通過用Wnt多肽如脂質(zhì)體Wnt多肽進(jìn)行的活體外處理增強(qiáng)骨移植物的成骨潛能。特別地，本發(fā)明涉及用Wnt3a蛋白，優(yōu)選脂質(zhì)體Wnt3a(L-Wnt3a)對骨移植物的活體外處理。
【背景技術(shù)】
[0002]矯形和牙科植入物用于多種關(guān)節(jié)和牙齒置換及促進(jìn)人體和動物中的骨修復(fù)，特別是髖和膝關(guān)節(jié)及牙齒的置換。雖然許多個體經(jīng)歷簡單的愈合和功能恢復(fù)，但也存在高的并發(fā)癥率，對于全關(guān)節(jié)置換估計為10-20%。植入物-骨骼界面處的故障造成這些失敗中的大部分并使得隨后的矯正手術(shù)成為必要。另外，用作正畸牙移動的錨固裝置的植入物據(jù)估計具有40%的失敗率且由于植入物-骨骼界面處的故障使得隨后布置另外的植入物成為必要。
[0003]矯形和牙科植入物由相對惰性的材料(“異種成形(alloplastic) ”材料)(通常金屬和陶瓷或塑料的組合)制成。之前用于改善矯形植入物手術(shù)的結(jié)果的途徑主要集中于植入物表面的物理改變，其設(shè)計為用于增加骨形成。這些途徑包括使用具有多孔金屬表面的植入物以促進(jìn)骨內(nèi)生和用輕磷灰石乳楽(hydroxyapatite plasma)噴射植入物。使用牙科植入物的途徑也包括使用形態(tài)增強(qiáng)的鈦表面，其中表面粗糙度通過如噴砂、酸蝕刻或氧化的方法賦予。
[0004]也試圖促進(jìn)骨整合，其中植入物表面發(fā)生大的改變。例如，包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的短肽連接于植入物的表面，因為細(xì)胞利用RGD序列以粘附于細(xì)胞外基質(zhì)。研究者嘗試再建這種細(xì)胞與改性的植入物表面的粘附，但這一策略僅導(dǎo)致植入物骨整合和機(jī)械固定的輕度增加?；蛘撸趪L試刺激植入物周圍的血管內(nèi)生時，它們的表面用包含血管生成生長因子VEGF的涂層涂覆。浸入鹽水溶液中的植入物已作為增加植入物骨整合的手段上市，但具有很少或沒有數(shù)據(jù)證實所聲稱的效果。
[0005]用于刺激骨整合的另一策略是使植入物表面納米織構(gòu)化(nano-texture)。這一策略的基本原理是織構(gòu)化增加表面積并因此防止植入物相對于在植入物周圍環(huán)境中的細(xì)胞“滑動”。但是在臨床試驗中，納米織構(gòu)化未產(chǎn)生可測量的益處。
[0006]用于刺激植入物骨整合的基于蛋白質(zhì)的方式的使用也已經(jīng)進(jìn)行了廣泛研究。重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)在骨折中誘導(dǎo)穩(wěn)健的骨形成且它們也已經(jīng)用于試圖刺激植入物周圍的直接骨形成。盡管體外結(jié)果是令人鼓舞的，但體內(nèi)數(shù)據(jù)仍然不能令人信服。重組BMP抑制骨髓腔中細(xì)胞的成骨分化并因此禁用于植入物骨整合。參見Sykaras等(2004)Clin OralInvestig 8 (4): 196-205 和 Minear 等(2010) Journal of Bone and Mineral Research25(6):1196-207oBMP的使用與異位骨化發(fā)生率的提高和不受控的炎癥相關(guān)，且較新的元數(shù)據(jù)分析也表明增加的癌癥風(fēng)險。
[0007]Wnt蛋白形成高度保守的分泌信號傳導(dǎo)分子的家族，其結(jié)合由Frizzled和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)編碼的細(xì)胞表面受體。WNT基因家族由編碼分泌的信號傳導(dǎo)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因組成。這些蛋白質(zhì)牽涉到腫瘤發(fā)生及幾種發(fā)育過程，包括細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控和胚胎發(fā)生過程中的模式形成。一旦結(jié)合，配體啟動細(xì)胞內(nèi)事件的級聯(lián)，其最終通過β-連環(huán)蛋白和DNA結(jié)合蛋白TCF的核活性導(dǎo)致革巴基因的轉(zhuǎn)錄(Clevers Η, 2004 Wntsignaling:lg-norrin the dogma.Curr B1l 14:R436_R437 ;Nelson WJ, Nusse R 2004Convergence of Wnt, beta-catenin, and cadherin pathways.Science 303:1483—1487;Gordon MD, Nusse 2006 Wnt signaling:Multiple pathways, multiple receptors, andmultiple transcript1n factors.J B1i Chem 281:22429-22433)。
[0008]Wnt也涉及到與骨發(fā)生的程序相關(guān)的廣泛的細(xì)胞決策。例如，Wnt調(diào)節(jié)sox9和runx2的表達(dá)水平，其影響間充質(zhì)祖細(xì)胞定型為軟骨生成或骨生成細(xì)胞的命運(yùn)。Wnt影響骨原細(xì)胞的分化率。在成年動物中，有大量證據(jù)證明Wnt信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)骨量。例如，人Wnt共受體LRP5中的功能獲得性突變與幾種高骨量綜合征相關(guān)，包括I型骨質(zhì)石化病和骨內(nèi)膜骨質(zhì)增生或常染色體顯性骨硬化病。Wnt功能喪失性突變引起低骨量疾病，包括骨質(zhì)疏松癥-假神經(jīng)膠質(zhì)瘤。Wnt抑制劑Dkkl的產(chǎn)生增加與多發(fā)性骨髓瘤(具有增加的骨吸收作為其區(qū)別特征之一的一種疾病)相關(guān)。對于進(jìn)一步的詳細(xì)信息，參見S.Minear等，Wnt proteins promote bone regenerat1n.Sc1.Transl.Med.2, 29ra30(2010)；Zhao 等,Controlling the in vivo activity of Wnt liposomes, Methods Enzymol465:331-47 (2009) ；Popelut 等,The accelerat1n of implant osseointegrat1n byliposomal Wnt3a, B1materials 31 9173e9181 (2010)和 Morrell NT, Leucht P, ZhaoL, Kim J-B, ten Berge D等(2008)Liposomal Packaging Generates Wnt Protein with InVivo B1logical Activity.PLoS ONE 3(8):e2930。
[0009]已證明將Wnt蛋白與脂質(zhì)囊泡(脂質(zhì)體)組合產(chǎn)生具有生物活性的Wnt制劑(Morrell 等,2008,同上；和 Zhao 等,2009,同上)(Minear 等,2010,同上；和 Popelut等，2010，同上)?？扇苄詿o翅蛋白(wingless protein)的生物活性描述于van Leeuwen等(1994) Nature 24:368 (6469): 3424中。使用可溶性生物活性脊椎動物Wnt蛋白對Wnt-Frizzled 相互作用的生物化學(xué)表征由 Hsieh 等(1999)Proc Natl Acad Sci US A96(7):3546-51 描述。Bradley 等(1995)Mo 1 Cell B1i 15 (8): 4616-22 描述了具有促有絲分裂活性的Wnt蛋白的可溶性形式。使用脂質(zhì)體Wnt蛋白增強(qiáng)骨整合描述于美國專利公開 N0.20120115788 中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]在一個方面，本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)骨移植物中的細(xì)胞存活的方法，包括使骨移植物經(jīng)歷Wnt多肽的活體外處理。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)骨移植物的成骨潛能的方法，包括使骨移植物經(jīng)歷有效劑量的Wnt多肽(包括，但不限于Wnt3A)的活體外處理。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種復(fù)活(revitalizing)來自具有降低的治愈潛能的受試者的骨移植物的方法，包括使骨移植物經(jīng)歷Wnt多肽的活體外處理。在所有方面中，骨移植物可以是自體移植物或同種異體移植物。在所有方面中，骨移植物可以包含干細(xì)胞群體，例如，舉例來說，骨髓來源的干細(xì)胞群體，例如骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0011 ] 骨移植物優(yōu)選來自人類受試者。在一個實施方式中，人類受試者是老年患者。在某些實施方式中，人類受試者至少50歲，至少55歲，至少60歲或至少65歲或至少70歲或至少75歲或至少80歲或至少85歲。在另一實施方式中，人類受試者具有降低的治愈潛能，例如，是吸煙者、糖尿病患者或特征在于營養(yǎng)缺陷的人。
[0012]在所有方面和實施方式中，Wnt多肽優(yōu)選為Wnt3a，更優(yōu)選人Wnt3a，最優(yōu)選脂質(zhì)體人Wnt3a(L-Wnt3a)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將骨移植物引入接受者如人類患者中的步驟。在各種實施方式中，骨移植物可以用于支持牙種植體、修復(fù)骨折。在另一實施方式中，骨移植物用于修復(fù)或重建病變的骨骼。在再另一實施方式中，骨移植物用于接受者的髖部、膝部或脊柱中。
【附圖說明】
[0013]圖1A-1J.骨移植物具有成骨潛能。圖1-A.從轉(zhuǎn)基因β肌動蛋白-增強(qiáng)綠色熒光蛋白(β -肌動蛋白-eGFP)雄性小鼠收獲的全骨髓的代表性等份樣品中總DNA的定量；各等份樣品構(gòu)成骨移植物。圖1-B.骨移植物移植到2-_直徑的臨界尺寸(critical-size)顱蓋缺陷(用圓圈界定)中，其在分隔頂骨的矢狀縫中形成(用垂直白色虛線描繪輪廓)。黑色虛線表示組織切片的平面。圖1-C.移植后第1天來自損傷位點的代表性組織切片；GFP免疫染色鑒別來自eGFP供體(η = 5)的移植細(xì)胞；下部空間代表矢狀竇。圖1_D.移植后第5天的代表性組織切片；溴脫氧尿苷(BrdU)的免疫染色鑒別S期的細(xì)胞。圖1-E.移植后第7天，GFP免疫染色鑒別骨移植物(黃色點線)；圖1-E中方框區(qū)域的更高放大倍數(shù)圖象(圖1-F)顯示損傷位點的大部分細(xì)胞源自GFP-陽性移植物。圖1-G.移植后第14天，微-CT重建確認(rèn)2-_顱蓋損傷構(gòu)成臨界尺寸的非愈合缺陷(η = 6)40。圖1-Η.用骨移植物處理的相同尺寸顱蓋損傷愈合(η = 6)。圖1-1和1-J.移植后第7天，苯胺藍(lán)染色用于鑒別新的骨樣基質(zhì)；沒有骨樣基質(zhì)在未處理的損傷位點中形成(黃色點線)。圖ι-J顯示用骨移植物處理的代表性樣品中移植后第7天的可見骨樣基質(zhì)?？s寫:IHC =免疫組織化學(xué)。箭頭標(biāo)明完整骨骼的邊緣。標(biāo)尺:2mm (圖1-B) ；200 ym(圖1-C和1-D) ;100μπι(圖1-Ε)；40 μπι(圖 1-F) ；2mm(圖 1-G)和 200 μm(圖 1-1 和 1-J)。
[0014]圖2A-21.來自老年動物的骨移植物中成骨潛能降低。在移植后第7天(d7)，苯胺藍(lán)染色表明通過來自年輕供體(圖2-A)與老年供體(圖2-B)的骨移植物產(chǎn)生的骨樣基質(zhì)。圖2-C.由年輕和老年骨移植物形成的新骨量的組織形態(tài)測定分析。圖2-D.在移植后第7天(d7)，綠色熒光蛋白(GFP)免疫染色鑒別在供體年輕時源自骨移植物的細(xì)胞，與老年供體(圖2-E)相比。圖2-F.當(dāng)移植物從年輕供體(藍(lán)色條，η = 13)收獲時與老年供體(白色條，η = 13)相比損傷位點中的GFP-陽性(GFP+ve)細(xì)胞數(shù)。在移植后第5天(d5)，溴脫氧尿苷(BrdU)染色鑒別來自年輕供體(圖2-G)和老年供體(圖2-H)的骨移植物中的增殖細(xì)胞。圖2-1.來自年輕和老年動物的骨移植物中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRTPCR)是等同的。單一星號表示p〈0.05。箭頭標(biāo)明完整骨骼的邊緣。標(biāo)尺:200 μπι(圖2-A。[圖2-Α中的標(biāo)尺也應(yīng)用于圖2-B]、2-D[圖2-D中的標(biāo)尺也應(yīng)用于圖2-E]和2-G[圖2-G中的標(biāo)尺也應(yīng)用于圖2-H])。
[0015]圖3.Wnt信號傳導(dǎo)在老年骨移植物中減少。圖3-A.評估從年輕供體(藍(lán)色條，η = 3)和老年供體(白色條，η = 3)收獲的骨髓(ΒΜ)中Wnt配體和Wnt靶基因(圖3-B)相對表達(dá)水平的定量RT-PCR。基因表達(dá)水平相對于甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)歸一化。星號表不p〈0.05。
[0016]圖4.脂質(zhì)體Wnt3a恢復(fù)老年骨移植物的成骨能力。圖4_A.L-PBS處理的老年骨移植物(η = 5)的苯胺藍(lán)染色。圖4-B.L-Wnt3a處理的骨移植物(η = 8)中新的苯胺藍(lán)陽性骨樣基質(zhì)。圖4-C.在移植后第7和12天新骨基質(zhì)的組織形態(tài)測定定量。圖4-D.L-PBS和L-Wnt3a(圖4-E)處理的骨移植物中移植后第12天(dl2)的苯胺藍(lán)染色。圖4-F.相對于如在來自收獲的骨髓的細(xì)胞群體(未粘附的浮動細(xì)胞和粘附的細(xì)胞)中測量的總DNA歸一化的β半乳糖苷酶(β -gal)活性。白色條(η = 4)代表L-PBS處理后的Wnt反應(yīng)性；藍(lán)色條(η = 4)代表L_Wnt3a處理(有效濃度0.15 μ g/mL Wnt3a)后的Wnt反應(yīng)性。圖4-G.源自骨髓的粘附細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物⑶45、⑶73、⑶105和Strol的免疫染色。圖4-H.相對于L-PBS處理后(白色條，n = 4)或L_Wnt3a處理后(η = 4 ;有效濃度0.15 μ g/mL Wnt3a)粘附細(xì)胞群體中的總DNA歸一化的β半乳糖苷酶(β-gal)活性。圖4-1.代表性組織切片上的Xgal染色鑒別來自老年Αχ?η2^ζ/+小鼠的L-PBS處理的骨移植物中的Wnt反應(yīng)性細(xì)胞，與L-Wnt3a處理(圖4-J)相比較。圖4-K.代表性組織切片上的Xgal染色鑒別來自年輕Axin2taeZ/+小鼠的L-PBS處理骨移植物中的Wnt反應(yīng)性細(xì)胞。單一星號代表 ρ〈0.05 ;四星號代表 ρ〈0.0001ο 縮寫:L-PBS =脂質(zhì)體 PBS ；L-ffnt3a =脂質(zhì)體 Wnt3a ；BM=骨髓jPDAPI = 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚，二氫氯化物。箭頭標(biāo)明完整骨骼的邊緣。標(biāo)尺:100mm (圖4-A [圖4-A中的標(biāo)尺也應(yīng)用于圖4-B]) ；200mm (圖4-D [圖4-D中的標(biāo)尺也應(yīng)用于圖4-E]) ； 100mm(圖4-G)和40mm(圖4-1，[圖4-1中的標(biāo)尺也應(yīng)用于圖4-J和4-K])。
[0017]圖5.L_Wnt3a處理恢復(fù)來自老年動物的骨移植物的成骨潛能。來自老年兔供體的骨髓，測定與細(xì)胞凋亡相關(guān)的DNA斷裂。圖5-A.末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色(η = 4)證明L-PBS(lOmL)處理的老年骨髓中的凋亡程度，與L_Wnt3a處理(圖5-B)(有效濃度=0.15 μ g/mL Wnt3a)相比。圖5_C.L-PBS處理(白色條)或L-Wnt3a處理(藍(lán)色條)的老年骨移植物樣品中半胱天冬酶活性的測量。圖5-D至5-G.骨髓從老年兔收獲，用L-PBS或L-Wnt3a孵育最多l(xiāng)h，然后移植到尺骨中形成的臨界尺寸缺陷中。圖5-D.骨移植后四周時的放射影像學(xué)評估。將L-PBS處理與L-Wnt3a處理(圖5-E)相比較。圖5-F.骨移植后八周時的微-CT等值面重建(iso-surface reconstruct1n)。將L-PBS處理與L-Wnt3a處理(圖5-G)相比交。圖5-H.骨體積(BV)和骨體積/總體積(BV/TV)使用GE MicroView軟件中的骨分析工具計算。單一星號表示p〈0.05?？s寫:L_PBS=脂質(zhì)體PBS和L-Wnt3a =脂質(zhì)體Wnt3a。箭頭標(biāo)明完整骨骼的邊緣。標(biāo)尺:40mm(圖5-A和 5-B)及 5mm (圖 5-F 和 5-G)。
[0018]圖6.源自L_Wnt3a處理老年骨移植物的再生骨的組織學(xué)外觀。用在L_PBS(圖6-A)或L-Wnt3a(圖6-B)中孵育的老年骨髓處理的損傷位點(加框區(qū)域)的苯胺藍(lán)染色。圖6-C.老年主體脂肪骨髓腔及接受L-PBS處理的老年骨移植物的鄰近