Lin28a基因過表達(dá)腺相關(guān)病毒在促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種Lin28a基因過表達(dá)腺相關(guān)病毒在促進(jìn)創(chuàng) 傷修復(fù)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，各種創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)切口的愈合仍然是臨床存在的一大難題，尤其是局部 放療傷口的愈合、糖尿病人傷口的愈合、大面積燒傷或褥瘡等難愈合傷口的愈合，給患者造 成巨大痛苦，也給醫(yī)療工作帶來巨大負(fù)擔(dān)。創(chuàng)傷修復(fù)是個復(fù)雜而漸進(jìn)的過程，而以往的研究 基本停留在等待傷口自愈階段，而缺乏促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的積極措施。
[0003] Lin28是存在于高等真核生物中的一種保守RNA結(jié)合蛋白，它是可以將人類體細(xì)胞 重新編程為多潛能干細(xì)胞的四種多能性因子之一，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化、新陳代謝以及細(xì) 胞多能性等方面起重要作用。在哺乳動物基因組中，存在兩個同源基因 Lin28a與Lin28b，兩 者序列相似度高達(dá)76%。1^1128&與Lin28b雖然在核酸序列上具有極高的相似性，但其在細(xì)胞 中的定位及具體功能卻有差異。在人類基因組中Lin28a定位于染色體1ρ36.11，蛋白質(zhì)編碼 區(qū)含有209個氨基酸殘基，其同源蛋白基因 Lin28b定位于染色體6p21，編碼一個含有250個 氨基酸殘基的小分子蛋白質(zhì)。由于Lin28a與Lin28b在功能上存在一定的差異，導(dǎo)致表達(dá)細(xì) 胞的類型也具有一定的特異性:Lin28b與多種癌癥的觸發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)，并在多種癌細(xì)胞系中 呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，提示其可能成為癌癥發(fā)生預(yù)測的標(biāo)志性分子;Lin28a的主要功能是調(diào) 控細(xì)胞的分化過程，因此廣泛表達(dá)于胚胎干細(xì)胞與早期胚胎形成時的細(xì)胞中，Lin28a基因 可通過調(diào)控糖酵解和氧化磷酸化反應(yīng)加強(qiáng)葡萄糖氧化代謝，能激活膠原蛋白，新生的膠原 蛋白能重新建立起膠原支架，提示Lin28a基因具有促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)能力。
[0004] 腺相關(guān)病毒(AAV)是一類微小、無被膜及具有二十面體結(jié)構(gòu)的細(xì)小單鏈DNA病毒。 近年來用AAV作基因轉(zhuǎn)移載體已成為基因治療研究的熱點。這是由于AAV具有以下特點：（1) 安全性好:迄今從未發(fā)現(xiàn)野生型AAV對人體致病;重組AAV去除了野生型AAV基因組的96%，進(jìn) 一步保證了安全性；（2)宿主范圍廣：不僅可轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞，而且可轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止期細(xì)胞；（3)野 生型AAV可整合到人基因組19號染色體q臂的特定位置，利用這一特點，有可能研制出具有 特異性整合功能的AAV載體；（4)AAV-2的基因組僅4681個核苷酸，便于用常規(guī)的重組DNA技 術(shù)進(jìn)行操作；（5)物理性質(zhì)穩(wěn)定:在60° C不能被滅活，能抗氯仿；（6)重組AAV(rAAV)可長期穩(wěn) 定地表達(dá)外源基因。腺相關(guān)病毒對許多哺乳動物細(xì)胞都比較易感，能夠轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類也 比較多，無論是細(xì)胞系，還是原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞，亦或是常規(guī)轉(zhuǎn)染試劑難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類 型，腺相關(guān)病毒都有很好的轉(zhuǎn)染效率，與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，具有瞬時轉(zhuǎn)染基因轉(zhuǎn)移效率更高的 優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供攜帶Lin28a基因的重組腺相關(guān)病毒（AAV_Lin28a)，將 Lin28a基因構(gòu)建入腺相關(guān)病毒載體，用于Lin28a基因的過表達(dá)，該AAV-Lin28a能促進(jìn)創(chuàng)傷 修復(fù)。
[0006] 本發(fā)明提供的Lin28a基因過表達(dá)腺相關(guān)病毒在促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)中的應(yīng)用，通過以下 技術(shù)方案來實現(xiàn)： 1. 人工合成Lin28a全基因組； 2. 將Lin28a基因插入到腺相關(guān)病毒載體上，利用pHelper質(zhì)粒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲 得重組腺相關(guān)病毒AAV_Lin28a，進(jìn)一步得到病毒濃縮液； 3. 建立皮膚表面創(chuàng)傷動物模型和合適的基因轉(zhuǎn)移方法，證明AAV-Lin28a可促進(jìn)皮膚創(chuàng) 傷愈合； 4. 建立猶度燒傷動物模型和合適的基因轉(zhuǎn)移方法，證明AAV-Lin28a可促進(jìn)深度燒傷 的真皮再生，并能抑制皮膚瘢痕形成； 5. 建立骨損傷動物模型和合適的基因轉(zhuǎn)移方法，證明AAV-Lin28a可促進(jìn)骨損傷修復(fù)； 6. 建立軟組織損傷動物模型和合適的基因轉(zhuǎn)移方法，證明AAV-Lin28a可促進(jìn)軟組織損 傷修復(fù)。
[0007] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明將Lin28a基因插入到腺相關(guān)病毒載體上，獲得一 攜帶Lin28a基因的重組腺相關(guān)病毒。該重組腺相關(guān)病毒制備方法簡單，能有效促進(jìn)皮膚創(chuàng) 傷的愈合，能顯著促進(jìn)部分深度燒傷的真皮再生，能促進(jìn)骨損傷和軟組織損傷修復(fù)，并能抑 制瘢痕形成。
【附圖說明】
[0008] 附圖1為三組動物皮膚創(chuàng)傷愈合率的變化趨勢圖。
[0009] 附圖2 為皮膚HE染色效果圖（A:AAV-Lin28a;B:AAV-MCS;C:PBS)。
【具體實施方式】
[0010] 下面給出實施例以對本發(fā)明作更詳細(xì)的說明，有必要指出的是以下實施例不能理 解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對本發(fā)明作出 的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整仍屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。 實施例
[0011] 實施例1重組腺相關(guān)病毒的制備。
[0012] 構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒載體。
[0013]由上海生物工程有限公司全基因合成Lin28a基因，構(gòu)建到PUC57載體中，得到 pUC57-Lin28a質(zhì)粒（測序結(jié)果見SEQ ID N0.1)。
[0014] 采用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI (購自Takara公司）雙酶切pUC57-Lin28a和pAAV-MCS腺相關(guān)病毒載體(購自Stratagene公司），酶切體系為:pAAV-MCS/pUC57-Lin28a質(zhì)粒： IOul，EcoRI :3ul，BamHI :3ul ,buffer :4ul，H2〇:20ul。37°C水浴30min，瓊脂糖凝膠電泳檢測 酶切產(chǎn)物，回收Lin28a基因片段和pAAV-MCS載體骨架(操作步驟參照Takara瓊脂糖核酸純 化回收試劑盒說明書）。
[0015] 將Lin28a基因插入酶切回收pAAV-MCS載體中（具體步驟參照Takara公司DNA Ligation Kit Ver. 2.1試劑盒說明書），連接體系為:Lin28a回收產(chǎn)物:2.5ul，pAAV-MCS 回收產(chǎn)物：2 · 5ul，Solution 1: 5ul。16°C孵育30min，取連接產(chǎn)物IOul加入IOOul DH5a感受 態(tài)細(xì)胞(購自Takara公司）中吹打均勻，冰上靜置20min，再放入42°C水浴90s，迅速置于冰 中，靜置3min，加入500ul LB液體培養(yǎng)基，180rpm、37°C振蕩培養(yǎng)lh，取菌液IOOul均勻涂布 于LB固體培養(yǎng)基(含1/1000氨芐青霉素），37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落于5ml LB培養(yǎng)基 (含1/1000氨芐青霉素）中，180rpm 37°C培養(yǎng)12h后提取質(zhì)粒(操作步驟參照Takara質(zhì)粒提 取試劑盒說明書）。
[0016]取樣送至上海生物工程有限公司測序驗證確認(rèn)正確。將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為PAAV-Lin28a〇
[0017]細(xì)胞株293FT的復(fù)蘇與培養(yǎng)。
[0018]取液氮凍存的293FT細(xì)胞株(購自Clontech公司），迅速放于37°C水浴中解凍，期間 不斷晃動使離心管內(nèi)溶液盡量受熱均勻；解凍后迅速加入7 m L體積分?jǐn)?shù)為10 %胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液中（DMEM培養(yǎng)液需要提前預(yù)熱至37°C)，槍頭輕輕吹打至無細(xì)胞團(tuán)存在，然后在 1300rpm條件下離心6min，棄去上清;再向離心管中加2 mL提前預(yù)熱至37°C體積分?jǐn)?shù)為10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞使其懸浮，按照5 X IO4個細(xì)胞將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，并于 37°C、含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后換液，以后每隔2天換液至細(xì)胞密度達(dá)90%時傳代。 [00 19] 病毒包裝。
[0020]轉(zhuǎn)染前一天，按照每瓶4 X IO5個293FT細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞約有 70%融合，轉(zhuǎn)染前4h，用無雙抗PBS清洗2次細(xì)胞，將含血清的培養(yǎng)液換為無雙抗、無血清的優(yōu) 化培養(yǎng)液0pti_MEM(2 mL/瓶）；LipofectamineTM2000(購自 Invitrogen公司）作為轉(zhuǎn)染試劑 將Lin28a轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞，具體步驟依照說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染體系為:卩!161?61' :10耶，？4八￥-RC：10ug, pAAV-Lin28a ：IOug,Lipofectamine 2000：60ug, Opti-MEM：2ml〇 [0021 ] 病毒收毒。
[0022]病毒顆粒同時存在于包裝細(xì)胞和培養(yǎng)上清中?？梢詫⒓?xì)胞和培養(yǎng)上清都收集下來 以獲得最好的收率： 1) 準(zhǔn)備一個干冰乙醇浴(將乙醇傾入裝有干冰的泡沫盒即可，也可用液氮替代干冰乙 醇浴)和37° C水??； 2) 將產(chǎn)毒的細(xì)胞連同培養(yǎng)基一同收集到一個15ml的離心管中。收集細(xì)胞時，將培養(yǎng)盤 傾斜一定角度將細(xì)胞刮到培養(yǎng)基中； 3) lOOOrpm/min，離心3分鐘，分離細(xì)胞和上清，將上清液另外存放，細(xì)胞用Iml PBS重 懸； 4) 將細(xì)胞懸浮液在干冰乙醇浴和37° C水浴中反復(fù)轉(zhuǎn)移，凍融四次。每次融解后稍加震 蕩。注意:每次凝固和解凍大概需要十分鐘的時間。
[0023] 病毒濃縮 1) 10，OOOg離心去除細(xì)胞碎片，將離心上清液轉(zhuǎn)移到一個新離心管中； 2) 將兩次收集的上清混合在一起，用0.45um濾器過濾除雜質(zhì)； 3) 加入1/2體積的IM NaCl，10% PEG8000溶液，混合均勻，4°C過夜； 4) 12，OOOrpm離心2h，棄上清，病毒沉淀用適量的PBS溶液溶解，待完全溶解后用0.22um 濾器過濾除菌； 5) 加入Benzonase核酸酶消化去除殘留的質(zhì)粒DNA(終濃度為50U/ml)。合上管蓋，顛倒 幾次以充分混合。在37°C孵育30分鐘； 6)用0.45μπι過濾頭過濾，取濾出液，即為濃縮的AAV病毒。
[0024] 病毒包裝滴度測定(采用Q-PCR法） 1) 取20ul濃縮病毒液，加入Iul RN