一種預(yù)防用h9n2型流感病毒樣顆粒疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種預(yù)防用H9N2型流感病毒樣顆粒疫苗 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] H9N2型流感病毒即甲型流感病毒的禽流感病毒一種亞型，它最早于20世紀(jì)末期被 發(fā)現(xiàn)存在于火雞之上。實(shí)驗(yàn)表明H9N2亞型流感病毒對(duì)雞具有較強(qiáng)的致病性，引起雞的免疫 力下降，繼發(fā)感染引起雞的大批死亡，引起蛋雞的產(chǎn)蛋下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，只具對(duì) 人的致病性弱，另一方面這種病毒的傳播很強(qiáng)，已經(jīng)有了較為廣泛的傳播。H9N2型流感病毒 不僅能讓機(jī)體發(fā)生免疫抑制，還可以讓各種繼發(fā)性的感染發(fā)生在宿主身上。據(jù)報(bào)道某地發(fā) 現(xiàn)豬已經(jīng)被這種病毒所感染。研究表明，這種病毒完全可以傳染到低等的哺乳動(dòng)物，人也可 以被這種病毒所感染。
[0003] 由于H9N2型流感病毒的潛在危害能力較為巨大，于是世界上越來越多的人對(duì)它進(jìn) 行了關(guān)注，越來越多的機(jī)構(gòu)對(duì)它進(jìn)行了研究，研究證明了其確實(shí)可以感染人類。研究還發(fā)現(xiàn) 病毒很有可能在人體里與其它的流感病毒亞型進(jìn)行基因重組，然后形成新的病毒亞型，危 害人類。
[0004] 目前的傳統(tǒng)疫苗主要用于雞的感染，而現(xiàn)有的傳統(tǒng)疫苗用分離的具有感染性的流 感病毒通過雞胚復(fù)制病毒制備，需要加滅活劑甲醛和油乳佐劑，對(duì)人類的食用存在不安全 的因素，并且生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜。同時(shí)由于它對(duì)人類存在的潛在危害，及在體內(nèi)為 其他病毒提供基因組基因而基因重組形成新亞型流感，危害人類安全，故為了人類的安全， 動(dòng)物禽流感的防控，防止H9N2型流感病毒的大規(guī)模、無節(jié)制的傳播，研制H9N2型流感病毒的 新型疫苗(VLP疫苗)很有必要且具有十分重要的經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：如何提供一種預(yù) 防用H9N2型流感病毒樣顆粒疫苗及其制備方法，彌補(bǔ)現(xiàn)在尚沒有H9N2型流感病毒樣顆粒疫 苗的空白，以防止H9N2型流感病毒在動(dòng)物之間傳播及向人類傳播，防止H9N2型流感病毒對(duì) 人類的潛在威脅，且具有安全性高、免疫原性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。
[0006] 實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種預(yù)防用H9N2型流感病毒樣顆粒疫 苗，其組分包括H9N2型流感病毒樣顆粒;其中，所述H9N2型病毒樣顆粒為H9N2型流感病毒的 病毒樣空殼顆粒結(jié)構(gòu)，所述空殼顆粒結(jié)構(gòu)的囊膜表面含有H9N2型流感病毒的一種或者多種 的結(jié)構(gòu)蛋白。
[0007] 所述結(jié)構(gòu)蛋白為H9N2型流感病毒的血凝素HA蛋白、神經(jīng)氨酸酶NA蛋白和/或基質(zhì) 蛋白Ml;其中，所述HA蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，編碼所述HA蛋白的核苷酸序 列如SEQIDN0.2所示;所述NA蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.3所示，編碼所述NA蛋白的 核苷酸序列如SEQIDN0.4所示;所述Ml蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.5所示，編碼所述 Ml蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。
[0008]上述預(yù)防用H9N2型流感病毒樣顆粒疫苗的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 1)根據(jù)SEQIDN0.2、SEQIDN0.4和SEQID勵(lì).6所示的核苷酸序列，合成骱、嫩 和Ml基因，并設(shè)計(jì)合成HA、ΝΑ和Ml基因的引物，供檢測(cè)之用；其中，HA基因的上游引物序列如 SEQIDN0.7所示，HA基因的下游引物序列如SEQIDN0.8所示，NA基因的上游引物序列如 SEQIDN0.9所示，NA基因的下游引物序列如SEQIDN0.10所示，Ml基因的上游引物序列如 SEQIDN0.11所示，Ml基因的下游引物序列如SEQIDN0.12所示；
[0010] 2)用限制性內(nèi)切酶BamHI和Notl對(duì)昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體pFastBac-DuaL和合成 的Ml基因進(jìn)行酶切并連接過夜后，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，抽提陽性克隆的重組質(zhì)粒DNA，得到重組質(zhì)粒pFastBac-DuaL-Ml;
[0011] 3)用限制性內(nèi)切酶SmaI和Nhe頂每對(duì)步驟2)得到的重組質(zhì)粒pFastBac-DuaL-Ml和 合成的HA基因進(jìn)行酶切并連接過夜后，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，抽提陽性克隆的重組 質(zhì)粒DNA，得到重組質(zhì)粒pFastBac-DuaL-HA-Ml;
[0012] 4)用限制性內(nèi)切酶Smal和Nhel酶對(duì)步驟3)得到的重組質(zhì)粒pFastBac-DuaL-HA-Ml和合成的ΝΑ基因進(jìn)行酶切并連接過夜后，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，抽提陽性克隆的重 組質(zhì)粒DNA，得到重組質(zhì)粒pFastBac-DuaL-HA-NA-Ml;
[0013] 5)將步驟4)得到的重組質(zhì)粒pFastBac-DuaL-HA-NA-Ml轉(zhuǎn)導(dǎo)入E.coLi感受態(tài)細(xì)胞 株DHlOBac細(xì)胞中，并經(jīng)過藍(lán)白篩選，挑取白色菌落，并提取質(zhì)粒，得到質(zhì)粒rBacmid-HA-NA-M1；
[0014] 6)將步驟5)得到的質(zhì)粒rBacmid-HA-NA-Ml轉(zhuǎn)染SF9昆蟲細(xì)胞，得到重組桿狀病毒；
[0015]7)將步驟6)得到的重組桿狀病毒感染SF9昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)后收集上清液，并對(duì)上清 液進(jìn)行純化，得到H9N2型流感病毒樣顆粒；
[0016] 8)將佐劑溶于步驟7)得到的所述H9N2型流感病毒樣顆粒中，于37°C下孵育3h后， 離心棄去上清液，對(duì)沉淀進(jìn)行清洗，即得到所述預(yù)防用H9N2型流感病毒樣顆粒疫苗。
[0017]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0018] 1、本發(fā)明H9N2型流感病毒樣顆粒(Virus-Likeparticles，VLP)是一種不含核酸 空心顆粒病毒，所述VLP上含有H9N2型流感病毒的一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白，雖然VLP是病毒顆 粒，但并沒有病毒的核酸物質(zhì)，所以VLP不能夠自主進(jìn)行復(fù)制，也不具有所有病毒都具有的 感染性，是一種空殼結(jié)構(gòu)，安全性高。
[0019] 2、本發(fā)明H9N2型流感病毒樣顆粒在結(jié)構(gòu)和形態(tài)上與完整的病毒非常的相似，表面 能夠呈現(xiàn)出高密度重復(fù)行，可進(jìn)行抗原表位的表達(dá)，從而可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較為強(qiáng)烈的免 疫應(yīng)答，免疫原性強(qiáng)，具有更廣泛的抗感染譜。
[0020] 3、本發(fā)明預(yù)防H9N2型流感用流感病毒樣顆粒疫苗以H9N2型流感病毒樣顆粒為有 效成分，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，雞只注射該疫苗后體溫、采食量、呼吸頻率、精神狀況和排泄物沒有 異常，體重呈正常的狀態(tài)，且接種了該疫苗的注射部位沒有肉眼可見的局部或全身反應(yīng);進(jìn) 一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明疫苗具有免疫保護(hù)作用，從HI實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出該疫苗的 免疫效果良好，高于傳統(tǒng)滅活疫苗，具有良好的市場(chǎng)前景;細(xì)胞免疫結(jié)果顯示該疫苗的刺激 指數(shù)SI達(dá)到有效刺激值，產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫。安全實(shí)驗(yàn)證明，該疫苗性能安全。
[0021] 4、本發(fā)明預(yù)防H9N2型流感用流感病毒樣顆粒疫苗穩(wěn)定性好，不容易失活，沒有在 消化道內(nèi)被酶分解掉;且本發(fā)明采用微球佐劑用來包埋H9N2型流感用流感病毒樣顆粒，包 埋效果良好，能有效保證病毒樣顆粒的活性不被破壞，使用微球佐劑的疫苗可以采用鼻內(nèi) 或肌肉注射的方式接種，疫苗的吸收效果好，除動(dòng)物應(yīng)用外，也適用于老年人、小孩等高危 人群的使用，給口服疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
[0022] 5、同其他疫苗相比，本疫苗毒株制備的疫苗具有免疫用量小，免疫次數(shù)少，免疫時(shí) 間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的市場(chǎng)潛力，能有效阻止H9N2型流感病毒對(duì)動(dòng)物和人類的侵害。 [0023] 6、本發(fā)明預(yù)防用H9N2型流感病毒樣顆粒疫苗采用基因工程的方法進(jìn)行制備，通過 構(gòu)建多基因共表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞獲得本發(fā)明病毒樣顆粒疫苗，制備過程中不易散 毒，制備方向更加可控，制備出的疫苗粗品相比現(xiàn)有其他方法制得的疫苗更容易進(jìn)行純化， 純化效率高，易于進(jìn)行篩選，純化后疫苗的滴度由2 6上升至21'純化效果良好。
【附圖說明】
[0024] 圖1為HA基因和NA基因PCR鑒定結(jié)果圖；
[0025]圖2為Ml基因PCR鑒定結(jié)果圖；
[0026]圖3為轉(zhuǎn)染前的SF9細(xì)胞圖；
[0027]圖4為轉(zhuǎn)染P3代重組病毒后的SF9細(xì)胞圖；
[0028]圖5為病毒顆粒的透射電鏡圖；
[0029]圖6為VLP顆粒的透射電鏡圖；
[0030]圖7為微球佐劑H9N2型疫苗在模擬胃液和人工腸液中的釋放速率圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合具體實(shí)施例和說明書附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0032] 一、一種預(yù)防用H9N2型流感病毒樣顆粒疫苗，其組分包括H9N2型流感病毒樣顆粒； 其中，所述H9N2型病毒樣顆粒為H9N2型流感病毒的病毒樣空殼顆粒結(jié)構(gòu)，所述空殼顆粒結(jié) 構(gòu)的囊膜表面含有H9N2型流感病毒的一種或者多種的結(jié)構(gòu)蛋白。
[0033]所述結(jié)構(gòu)蛋白可以是H9N2型流感病毒的血凝素HA蛋白、神經(jīng)氨酸酶NA蛋白和基質(zhì) 蛋白Ml;其中，所述HA蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，編碼所述HA蛋白的核苷酸序 列如SEQIDN0.2所示;所述NA蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.3所示，編碼所述NA蛋白的 核苷酸序列如SEQIDN0.4所示;所述Ml蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.5所示，編碼所述 Ml蛋白的核苷酸序列如SEQIDN0.6所示。
[0034]上述預(yù)防用H9N2型流感病毒樣顆粒疫苗的組分還可以包括佐劑;所述佐劑可以是 微球佐劑，采用如下方法制備：
[0035] 1)將乙酸、吐溫-80、水和殼聚糖混合均勻，配制成混合溶液，所述混合溶液中殼聚 糖的質(zhì)量濃度為〇. 25%~0.3%、乙酸的質(zhì)量濃度為2%~2.5%、吐溫-80的質(zhì)量濃度為1 % ~1.2% ;
[0036] 2)在磁力攪拌和超聲作用下，將質(zhì)量濃度為10%~15%的Na2S〇4溶液以1~1.2mL/ min的速度滴入步驟1)配制的混合溶液中，持續(xù)磁力攪拌和超聲作用20~25min后，以2750 ~3500r/min離心20~30min，用超純水清洗離心沉淀物，以2750~3500r/min離心20~ 3〇min，再次重復(fù)兩