一種治療大腸癌的藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種藥物，尤其設(shè)及一種治療大腸癌的藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸癌是一種形勢(shì)嚴(yán)峻的全球性疾病。2012年，近70萬(wàn)人死于大腸癌，新增病例 140萬(wàn)?；熓峭砥诖竽c癌的主要治療方法。傳統(tǒng)化療藥物的細(xì)胞毒作用常引起不同程度的 毒副反應(yīng)及組織臟器的損傷，嚴(yán)重影響病人的生存質(zhì)量。祀向治療是在細(xì)胞分子水平上，針 對(duì)已經(jīng)明確的致癌位點(diǎn)（腫瘤細(xì)胞內(nèi)的蛋白分子或基因片段)設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療藥物，藥物進(jìn) 入體內(nèi)會(huì)特異地結(jié)合致癌位點(diǎn)，使腫瘤細(xì)胞特異性死亡，而不波及正常組織細(xì)胞，代表了腫 瘤治療的新方向。但是，由于腫瘤基因組的復(fù)雜性和高概率的基因突變，導(dǎo)致包括大腸癌在 內(nèi)的大部分腫瘤對(duì)單一祀點(diǎn)的祀向治療耐藥，因此推出新的系統(tǒng)療法變得十分迫切。
[0003] p38MAPK(p38絲裂原活化蛋白激酶）和mTOR(雷帕霉素祀體蛋白）被作為腫瘤祀向 治療的祀點(diǎn)而廣為研究。P38MAPK是細(xì)胞對(duì)熱、紫外福射、炎癥因子等壓力刺激作出反應(yīng)的 關(guān)鍵調(diào)控因子。P38MAPK蛋白有p38a、p380、p38 丫和p3如四個(gè)亞基，p38a亞基相對(duì)其它S種 更普遍存在。P38MAPK憐酸化包括轉(zhuǎn)錄因子和激酶在內(nèi)的大量底物，運(yùn)些底物在炎癥反應(yīng)、 細(xì)胞分化、細(xì)胞周期和調(diào)亡中發(fā)揮重要作用。越來(lái)越多的證據(jù)顯示P38MAPK在許多（包括癌 癥在內(nèi)的）其它疾病中同樣扮演重要角色。大腸癌、乳腺癌、濾泡性淋己瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭 頸部鱗癌、肺癌、甲狀腺癌中都顯示p38a表達(dá)明顯升高。臨床前研究顯示:在部分大腸癌中， p38a和p380對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖至關(guān)重要，祀向抑制p38a和p3地能夠增加大腸癌對(duì)5-氣尿喀晚和伊立替康的敏感性。但是在部分對(duì)P38MAPK激酶抑制劑耐藥的大腸癌，P38MAPK 激酶抑制劑并不能抑制腫瘤生長(zhǎng)。
[0004] mTOR是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的核屯、分子，它直接參與兩個(gè)激酶復(fù)合物mTORCl和mT0RC2的 形成。mTORCl控制細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝過(guò)程，mT0RC2調(diào)節(jié)細(xì)胞存活。臨床前研究顯示:部分大腸 癌對(duì)mTOR激酶抑制劑敏感，mTOR激酶抑制劑單藥可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)。但是在部分耐藥大 腸癌，mTOR激酶抑制劑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題提出的一種治療大腸癌的藥物，對(duì)P38MAPK 激酶抑制劑和mTOR激酶抑制劑耐藥的大腸癌均具有良好治療效果。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn) 題所采取的技術(shù)方案為：
[0006] 一種治療大腸癌的藥物，T0R38,由P38MAPK激酶抑制劑、mTOR激酶抑制劑和輔助劑 組成;其中，P38MAPK激酶抑制劑為SB202190，mT0R激酶抑制劑為0SI027。
[0007] 為了優(yōu)化上述的技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：
[000引優(yōu)選地，SB202190與0SI027的質(zhì)量比為1:2~1:3。
[0009] 優(yōu)選藥物為注射劑。
[0010] 優(yōu)選地，上述藥物為液體注射劑或注射用粉劑。
[0011] 優(yōu)選地，上述輔助劑為緩沖溶液，所述緩沖溶液包括水和有機(jī)組分。
[0012] 優(yōu)選地，上述有機(jī)組分選自注射用大豆油、乙醇、丙二醇、聚乙二醇，吐溫-80、司 盤-85、普流羅尼F-68、簇甲基纖維素、海藻酸鋼、聚乙締化咯燒酬、明膠、甘露醇、山梨醇、 單硬脂酸侶或硅油的一種或幾種，水為注射用水。
[0013] 優(yōu)選地，上述藥物的還可W為口服的片劑或顆粒膠囊。
[0014] 另一方面，本發(fā)明還提供上述的藥物在制備治療大腸癌的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果:本發(fā)明的治療大 腸癌的藥物，針對(duì)P38MPK激酶抑制劑和mTOR激酶抑制劑耐藥的大腸癌均具有治療效果，治 療效果相較傳統(tǒng)藥物療效穩(wěn)定，為大腸癌的化療提供了一種新的藥物和治療思路。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為橫酷羅丹明B(SRB)比色法測(cè)定的不同藥物抑制大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)果。沖< 0.0 lvs. SB202190 ；★?<0.0 lvs. 0SI027〇
[0017] 圖2為平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中測(cè)定不同藥物抑制大腸癌細(xì)胞克隆形成的結(jié)果(大腸 癌細(xì)胞分別用58202190,051027，1'01? 38干預(yù)。柱狀圖為平板克隆形成結(jié)果的定量，*口< 0.Olvs.SB202190;^p(O-Oivs-OSIOST)C
[0018] 圖3為軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)中測(cè)定不同藥物抑制大腸癌細(xì)胞軟瓊脂集落形成的結(jié) 果（大腸癌細(xì)胞分別用SB202190,0SI027，T0R 38干預(yù)。柱狀圖為軟瓊脂集落形成結(jié)果的定 量，沖<0.0 lvs. SB202190 ;★?<0.0 lvs.0SI027)。
[0019] 圖4為通過(guò)叮晚澄染色分析藥物處理大腸癌細(xì)胞72小時(shí)后的調(diào)亡情況(大腸癌細(xì) 胞分別用SB202 190 ,OS I 027 ,TOR38處理72h，然后進(jìn)行日丫晚澄染色并計(jì)數(shù)。*P< 0.Olvs.SB202190;^p(O-Oivs-OSIOST)C
[0020] 圖5為通過(guò)PARP剪切實(shí)驗(yàn)分析藥物處理大腸癌細(xì)胞72小時(shí)后的調(diào)亡情況(大腸癌 細(xì)胞分別用58202190,051027，1'01? 38處理7211，然后收集細(xì)胞并抽提細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行 western blot檢測(cè)）。
[0021] 圖6為免疫組化分析動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中分別用不同藥物處理后大腸癌移植瘤的P-S6和 Ki67表達(dá)情況。（P-S6代表mTOR信號(hào)通路活性，Ki67代表腫瘤細(xì)胞增殖能力）。
[0022] 圖7為Western blot分析動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中分別用不同藥物處理后大腸癌移植瘤的mTOR 信號(hào)通路活性和P38MAPK信號(hào)通路活性。（P-S6K、P-AKT代表mTOR信號(hào)通路活性，P-MK2、P-HSP27代表P38MAPK信號(hào)通路活性）。
[0023] 圖8為用TU肥L染色分析動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中不同藥物處理后大腸癌移植瘤的細(xì)胞調(diào)亡情 況。柱狀圖為大腸癌移植瘤細(xì)胞調(diào)亡結(jié)果的定量。數(shù)據(jù)代表均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n = 10)，巧< 0.0 lvs. SB202190 ；★?<0.0 lvs. 0SI027〇
[0024] 圖9為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中不同藥物處理后大腸癌移植瘤的體積(腫瘤體積數(shù)據(jù)代表均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(n = 10)，沖 <0.0 lvs. SB202190，★?<0.0 lvs. 0SI027)。
【具體實(shí)施方式】
[002引本發(fā)明提供了一種治療大腸癌的藥物，由P38MAPK激酶抑制劑、mTOR激酶抑制劑和 輔助劑組成;其中，P38MAPK激酶抑制劑為SB202190，mT0R激酶抑制劑為0SI027。
[0026] 下面通過(guò)具體實(shí)施例(實(shí)驗(yàn))對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，W使更好的理解本 發(fā)明，但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。如無(wú)特殊說(shuō)明，實(shí)施例中各個(gè)體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的 大腸癌細(xì)胞系肥Tl 16、SWl 116、SW620均購(gòu)自ATCC，按照ATCC說(shuō)明培養(yǎng)。S種細(xì)胞系均設(shè)置對(duì) 照組、SB202190作用組、0SI027作用組W及TOR 38作用組【SB202190+0SI027聯(lián)合作用組（即本 申請(qǐng)的藥物)】。體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、SB202190作用組、0SI027作用組W及TOR 38作用組 【SB202190+0SI027聯(lián)合作用組（即本申請(qǐng)的藥物)】。
[0027] 實(shí)施例一橫酷羅丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法
[002引實(shí)驗(yàn)采用S種大腸癌細(xì)胞系HCTl 16、SWl 116、SW620, S種細(xì)胞系均設(shè)置對(duì)照組、 SB202190作用組、0SI027作用組W及TOR38作用組【SB202190+0SI027聯(lián)合作用組（即本申請(qǐng) 的藥物)】。具體的實(shí)驗(yàn)方法為：
[0029] (1)取剛剛長(zhǎng)成完整單層的細(xì)胞一瓶，膜蛋白酶消化后收集細(xì)胞，用移液管吹打均 勻，取兩滴細(xì)胞懸液臺(tái)吩藍(lán)染色，于顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目（死細(xì)胞數(shù)目不得超過(guò)5% )， 用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)目至1 X 105個(gè)細(xì)胞/毫升。
[0030] (2)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入1 OOiil細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板置于C02培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)24小時(shí)，取出培養(yǎng)板后于每孔中加入不同濃度的待測(cè)樣品的完全培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè) 平行孔，另設(shè)A行細(xì)胞加入不含藥完全培養(yǎng)液作正常對(duì)照孔(C)。
[0031 ] (3)加藥完成后，吸出空白孔中培養(yǎng)液，去離子水洗5遍。培養(yǎng)板于微孔板振蕩器上 振蕩混勻，置于C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
[0032] (4)取出培養(yǎng)板，在培養(yǎng)液表面每孔輕輕加入50山預(yù)冷的50%的S氯醋酸(TCA)固 定，靜置5分鐘后，再將培養(yǎng)板移至4°C放置1小時(shí)。
[0033] (5)倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入10化1 SRB液， 在室溫放置10分鐘，未與蛋白質(zhì)結(jié)合的SRB用1 %醋酸洗5遍，空氣干燥。結(jié)合的SRB用15化1 lOmmol/L非緩沖化is堿液(P化