一種同時(shí)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)樹突細(xì)胞遷移至淋巴結(jié)和多模式成像的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物科學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種促進(jìn)樹突細(xì)胞迀移至淋巴組織，并能對該迀移過程進(jìn)行多模式成像監(jiān)測的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DC疫苗是通過采用病人自體的單核細(xì)胞在體外培養(yǎng)誘導(dǎo)生成DC，然后負(fù)載相應(yīng)的腫瘤抗原并刺激成熟而獲得。若要高效地發(fā)揮其治療作用，成熟的DCXmature DC，mDC)必須迀移至病人的淋巴結(jié)組織并與幼稚T細(xì)胞相互作用。已有大量研究證據(jù)表明，DC所產(chǎn)生的體內(nèi)免疫反應(yīng)與攜帶相關(guān)腫瘤抗原的成熟DC迀移至次級(jí)淋巴組織的效率成正相關(guān)。雖然近期的臨床預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示DC疫苗具有良好的治療效果，但是僅有不到2%的注射進(jìn)入體內(nèi)的DC到達(dá)次級(jí)淋巴組織。因此，若要提升DC疫苗治療功效，其中關(guān)鍵的一步在于如何提高DC在體的迀移效率。目前的研究主要集中在通過探索DC在體迀移的分子機(jī)制來解決DC迀移效率低的問題。Fontecha等人發(fā)現(xiàn)采用腫瘤壞死因子(TNF)或白細(xì)胞介素(IL-la)等炎癥因子預(yù)免疫小鼠，可以增強(qiáng)其淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞對于趨化因子CCL21的表達(dá)，從而引導(dǎo)DC細(xì)胞更高效地迀移。Weber等人于2013年1月在Science上發(fā)表文章，指出通過構(gòu)建模型證實(shí)了 DC在體迀移主要取決于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的CCL21的濃度。闡明DC的迀移機(jī)制在一定程度上可以指導(dǎo)今后的DC疫苗設(shè)計(jì)，但是采用炎癥因子預(yù)刺激存在以下問題:1)DC迀移率仍較低(<3% );2)在DC接種量較高時(shí)(> 2 X 106)，預(yù)刺激基本不起作用；3)高劑量的炎癥因子在體給藥存在一定的不良反應(yīng);4)預(yù)刺激可以提高體內(nèi)CCL21的濃度梯度水平，但無法實(shí)現(xiàn)對DC迀移的直接控制。因此，迫切需要開發(fā)更加高效、安全和可控的技術(shù)手段來提高DC的活體迀移效率。
[0003]磁力牽引是借用磁體異極相吸的原理而產(chǎn)生的一種方法，目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。Susan P.Foy合成了一種裝載氧化鐵的納米顆粒(magneticnanopart i c 1 e，麗P)經(jīng)小鼠尾靜脈給藥后，利用外加磁場提高了 MNP在腫瘤組織中的蓄積。Alain Luciani將攝取MNP的Huh7肝癌細(xì)胞經(jīng)脾臟注射到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)利用磁力牽引可以顯著性地提高Huh7在肝臟外周血管周圍的數(shù)量。目前還未有報(bào)道利用磁力牽引來提高DC的活體迀移效率。目前的研究已表明磁力牽引具有特異性好、安全和可控等優(yōu)點(diǎn)，因此有望解決DC活體迀移效率低的難題。
[0004]另外，DC疫苗的優(yōu)化要求建立非創(chuàng)傷性的成像手段來動(dòng)態(tài)地監(jiān)測DC迀移至淋巴組織的過程，從而實(shí)現(xiàn)在治療過程中快速評價(jià)DC疫苗的效果。將這些造影劑標(biāo)記DC主要是通過納米運(yùn)輸載體實(shí)現(xiàn)，包括量子點(diǎn)、磁性納米顆粒和聚合物納米材料等。其中，采用納米載體攜帶多種造影劑(尤其是近紅外和MRI探針)進(jìn)行多模式成像可以兼顧成像檢測靈敏度和空間分辨率。為了滿足以上需求，納米顆粒的設(shè)計(jì)必須滿足以下要求:1)生物相容性好;2)能被DC高效地?cái)z取;3)能同時(shí)包裹腫瘤抗原、近紅外和磁性MRI探針;4)在應(yīng)用于腫瘤治療時(shí)，攜帶的腫瘤抗原能被優(yōu)先遞送到DC的胞漿中而不是內(nèi)體/溶酶體中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為解決上述問題而提供了一種促進(jìn)樹突細(xì)胞迀移至淋巴組織，并能對該迀移過程進(jìn)行多模式成像監(jiān)測的方法，利用該方法能有效提高DC的腫瘤防治功效。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0007]一種同時(shí)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)樹突細(xì)胞迀移至淋巴結(jié)和多模式成像的方法，所述方法由成熟樹突細(xì)胞(mDCs)攜帶磁性焚光納米顆粒在外加磁場下實(shí)現(xiàn)。
[0008]進(jìn)一步地，所述磁性熒光納米顆粒是由油酸酯-磁性氧化鐵顆粒、兩種磷脂、近紅外探針和一種具有脂質(zhì)結(jié)合能力的抗原融合肽通過自組裝有機(jī)結(jié)合形成。
[0009]進(jìn)一步地，所述的磷脂為DMPC和MHPC。
[0010]進(jìn)一步地，所述的近紅外探針為ICG分子。
[0011]進(jìn)一步地，所述的具有脂質(zhì)結(jié)合能力的抗原融合肽是由α螺旋多肽、連接序列和抗原肽以共價(jià)鍵的形式串連而成。
[0012]進(jìn)一步地，所述α螺旋多肽的氨基酸序列為FAEKFKEAVKDYFAKFWD，所述連接序列的氨基酸序列為GSG，所述抗原肽的氨基酸序列為KVPRNQDWL、KTWGQYWQV、SIINFEKL或ISQAVHAAHAEINEAGR。
[0013]進(jìn)一步地，所述外加磁場為磁鐵產(chǎn)生或者恒定外加磁場。
[0014]本發(fā)明提供的一種同時(shí)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)樹突細(xì)胞迀移至淋巴結(jié)和多模式成像的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0015](1)生物相容性好:本發(fā)明方法中所選用的材料，磷脂、ICG、氧化鐵顆粒和抗原融合肽，這些原材料都已用于臨床或臨床試驗(yàn)，具有良好的生物相容性。
[0016](2)操作工藝簡單，有望應(yīng)用于臨床。
[0017](3)能大幅提尚DC的活體遷移效率。
[0018](4)能同時(shí)進(jìn)行DC的活體多模示蹤和腫瘤免疫治療:mDCs攝取磁性熒光納米顆粒后，其活體分布可以采用近紅外光學(xué)成像和磁共振成像進(jìn)行示蹤；由于磁性熒光納米顆粒含有抗原融合肽，因此可以用于腫瘤的預(yù)防和治療。
[0019](5)采用磁力牽引能顯著增強(qiáng)mDCs的抗癌功效。
[0020](6)功能可擴(kuò)展:該系統(tǒng)除了直接應(yīng)用于DC疫苗外，還可以在其表面裝載免疫佐劑直接作為納米疫苗，同時(shí)實(shí)現(xiàn)在體免疫細(xì)胞的激活、抗原高效遞送、磁力牽引和多模成像。
【附圖說明】
[0021]圖1為所述磁性熒光納米顆粒的透射電子顯微鏡成像圖像和動(dòng)態(tài)激光光散射(DLS)圖。
[0022]圖2為磁性熒光納米顆粒的磁共振信號(hào)和熒光信號(hào)成像圖。
[0023]圖3為mDCs攝取磁性熒光納米顆粒的流式細(xì)胞圖。
[0024]圖4為攝取磁性熒光納米顆粒對DC生存率的影響。
[0025]圖5為攝取磁性熒光納米顆粒的mDCs的熒光成像圖。
[0026]圖6為攝取磁性熒光納米顆粒的mDCs的普魯士藍(lán)染色圖。
[0027]圖7為磁力牽引對DC迀移能力的影響研究。
[0028]圖8為小鼠足墊回輸mDCs在24后的多模式成像(近紅外和磁共振)圖。
[0029]圖9為mDCs后的近紅外熒光成像圖以及磁力牽引實(shí)施24小時(shí)后的熒光成像圖。
[0030]圖10為實(shí)施磁力牽引前后小鼠腿彎淋巴結(jié)熒光成像對比圖。
[0031]圖11為流式檢測含磁性熒光納米顆粒的DC在促進(jìn)特異性淋巴細(xì)胞增值方面的能力。
[0032]圖12為在有無磁場作用下DC抗腫瘤疫苗功效的對比研究。
【具體實(shí)施方式】
[0033]本發(fā)明實(shí)施例提供一種同時(shí)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)樹突細(xì)胞迀移至淋巴結(jié)和多模式成像的方法。具體步驟如下:
[0034]l)mDCs的制備:DC的制備來源性骨髓提取分離，mDCs的制備采用常規(guī)培養(yǎng)方法獲得，可以攜帶腫瘤抗原，也可以不含腫瘤抗原。DC可以是來源于骨髓提取，也可以是DC2.4細(xì)胞系。
[0035]2)mDCs攜帶多肽抗原和磁性物質(zhì):mDCs與一種磁性熒光納米顆粒在37°C下孵育6小時(shí)即可完成。
[0036]所述磁性熒光納米顆粒是由油酸酯-氧化鐵顆粒、兩種磷脂、近紅外探針和一種具有脂質(zhì)結(jié)合能力的抗原融合肽通過自組裝有機(jī)結(jié)合形成。
[0037]所述油酸酯-氧化鐵顆粒是油酸修飾氧化鐵后的納米顆粒，該物質(zhì)已經(jīng)投入商業(yè)化生產(chǎn)(見http: //www.nanoeast.net/cxnmklfzxs.html，油酸修飾的四氧化三鐵磁性納米顆粒(0A@Fe304，共沉淀法或高溫?zé)峤夥?
[0038]【產(chǎn)品名稱】
[0039]油酸修飾的四氧化三鐵磁性納米顆粒
[0040]【英文名稱】
[0041 ] 0A coated Fe304nanopartic 1 es
[0042]【成分】
[0043]油酸修飾的Fe304磁性納米顆粒
[0044]【特點(diǎn)】
[0045]油溶性，可分散在環(huán)己烷、氯仿、四氫呋喃等溶劑中.
[0046]【用途】
[0047 ]用于摻雜水包油納米乳、修飾納米脂質(zhì)體、構(gòu)建磁性納米藥物等。
[0048]【技術(shù)參數(shù)】
[0049]TEM 尺寸:約 10nm
[0050]飽和磁化強(qiáng)度:約75emu/g Fe。
[0051 ]優(yōu)選地，所述磷脂為DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero_3-phosphocholine)和MHPC(lipidsl-myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine)。
[0052]優(yōu)選地，所述近紅外探針為ICG分子(吲哚氰綠/心臟綠)。
[0053]所述具有脂質(zhì)結(jié)合能力的抗原融合肽，是由α螺旋多肽、連接序列和抗原肽以共價(jià)鍵的形式串連而成，所述α螺旋多肽的氨基酸序列為FAEKFKEAVKDYFAKFWD，所述連接序列的氨基酸序列為GSG，所述抗原肽的氨基酸序列為KVPRNQDWL、KTWGQYWQV、ISQAVHAAHAEINEAGR或其它抗原多肽序列。
[0054]3)磁場作用下促進(jìn)DCs活體迀移至淋巴組織:本發(fā)明使用圓形的磁鐵N35(40X10mm；Gauss,11.7-12.1k)用來引導(dǎo)含磁性焚光納米顆粒的mDCs的迀移，但不局限于磁鐵發(fā)出的磁場，恒定的磁場也可以用于上述應(yīng)用。
[0055]下面結(jié)合附圖和實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0056]實(shí)施例1
[0057]組成磁性熒光納米顆粒的抗原融合多肽，該肽是由α螺旋多肽(R4F)、連接序列和抗原肽(ΑΡ )以共價(jià)鍵的形式串連而成。其中α螺旋多肽的氨基酸序列為:FAEKFKEAVKDYFAKFWD，連接序列的氨基酸序列為GSG，抗原肽的氨基酸序列為:KVPRNQDWL。該多肽的氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0.1所述。
[0058]制備磁性熒光納米顆粒，其步驟為:
[0059]磁性熒光納米顆粒的制備:稱取DMPC和羥丙基甲基纖維素醚(MHPC)各5mg分別置于EP管中，然后在EP管中加入200μ1的三氯甲烷進(jìn)行溶解，將溶解好的DPMC和MHPC轉(zhuǎn)移至體積為約為400μ1含氧化鐵的氯仿溶液中(10mg/mL)，再按氯仿: