復(fù)合生物活性因子的凍干方法及凍干粉的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種復(fù)合生物活性因子的凍干方法 及凍干粉。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物活性因子由多種細(xì)胞類型通過(guò)旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌的方式產(chǎn)生，能夠調(diào) 節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫等功能，尤其能夠有效的與皮膚細(xì)胞發(fā)生作用，參與炎癥發(fā)生和 創(chuàng)傷愈合。例如：生物活性因子能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)代謝，預(yù)防皮膚受到紫外線、自由 基等侵害；生物活性因子還能促使真皮層膠原細(xì)胞的增生，加速術(shù)后皮膚的修復(fù)。
[0003] 常見(jiàn)的細(xì)胞分泌的生物活性因子有EGF(中文；表皮生長(zhǎng)因子，英文；epidermal growth factor)，BFGF(中文；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，英文；basic fibroblast growth factor)，VEGF(中文；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，英文；vascular endothelial growth factor) 等。包含多種生活因子的組合體可W稱為復(fù)合生物活性因子。復(fù)合生物活性因子除了具備 各種生物活性因子自身的功能外，各種生物因子之間還可W相互促進(jìn)，所W，復(fù)合生物活性 因子在醫(yī)療和化妝品等行業(yè)具有重要作用。
[0004] 復(fù)合生物活性因子的保存方法直接影響其生物活性的高低W及保存時(shí)間的長(zhǎng)短， 進(jìn)而影響復(fù)合生物活性因子的應(yīng)用。對(duì)于生物制品，常見(jiàn)的保存方法有冷凍干燥保存方法， 冷凍干燥又稱升華干燥，是將需要干燥的物料溶液預(yù)先凍結(jié)成固體，然后在低溫低壓條件 下，從凍結(jié)狀態(tài)不經(jīng)過(guò)液態(tài)而直接升華去除水分的一種干燥方法。此過(guò)程中物料的干燥是 在凍結(jié)狀態(tài)下完成的，所W物料的組織結(jié)構(gòu)和外觀形態(tài)將會(huì)被較好地保存。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)也不乏利用冷凍干燥方法獲取的生物制品，例如，公開(kāi)號(hào)為 CN101444619A的專利，提供了一種不含人血白蛋白的細(xì)胞因子凍干制劑配方，并具體公開(kāi) 了該配方的組成為：
[0006] 蠶組人干挽素a 2b; 5腑巧IU/放L 甘蘊(yùn)醇; 4.0%
[0007] 吐潑織： 斯村?。?甘氯酸： 2.0% 罐發(fā)鹽纔沖液〇pH7.0): 50mM。
[0008] 再例如，公開(kāi)號(hào)為CN103251649A的專利提供一種人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍 干粉及其制備方法，并具體公開(kāi)了該凍干粉的制備過(guò)程為；在超凈工作臺(tái)中用50mL無(wú)菌離 必管收集低傳代數(shù)的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清液，在4°C，400g離必15min ;在超凈工作 臺(tái)中打開(kāi)離必管，用無(wú)菌槍頭吸出離必管中的上清液至一無(wú)菌的收集管中，棄沉淀，記錄標(biāo) 志，-8(TC凍存凝固備用；將-8(TC凍存凝固的上清液抽真空，升華干燥，除去冰晶。最后制 得凍干粉，-2(TC保存。將篩選合適的陽(yáng)性菌株進(jìn)行擴(kuò)大化培養(yǎng)，離必收集菌體，用細(xì)胞裂解 液裂解后經(jīng)超聲破碎，離必收集上清，陽(yáng)離子交換層析粗提融合蛋白。層析峰上Ni金屬親 和層析提純?nèi)诤系鞍?，收集蛋白峰過(guò)Se地adex G50柱除鹽，獲得目標(biāo)蛋白。
[0009] 但是現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)的冷凍干燥方法都存在一些缺陷，不利于復(fù)合生物活性因子的 凍干保存，例如，在公開(kāi)號(hào)為CN101444619A的專利中，采用了吐溫系列，該系列物質(zhì)有溶血 作用，會(huì)限制復(fù)合生物活性因子凍干粉后期的使用；并且凍干過(guò)程中加有磯酸鹽緩沖液，其 中含有大量的鹽分，會(huì)降低復(fù)合生物活性因子的活性。公開(kāi)號(hào)為CN103251649A的專利中， 在升華干燥前液體需要-8(TC凍存凝固，非常耗費(fèi)能量，導(dǎo)致成本增加；并且獲得的凍干粉 需要-2(TC保存，保存條件非?？量?，不利于保存和運(yùn)輸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的主要目的在于，提供一種復(fù)合生物活性因子的凍干方法及凍干粉，提高 復(fù)合生物活性因子凍干粉的生物活性和穩(wěn)定性，且能夠在冷藏或者常溫下保存較長(zhǎng)時(shí)間。
[0011] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0012] 一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供一種復(fù)合生物活性因子的凍干方法，包括：
[0013] 將保護(hù)劑與5-10份包含復(fù)合生物活性因子的溶液混合所得的混合液依次經(jīng)過(guò)預(yù) 凍、加強(qiáng)預(yù)凍、升華干燥和解析干燥處理；
[0014] 其中，所述保護(hù)劑包括5-10份多元醇，所述混合液除所述保護(hù)劑和復(fù)合生物活性 因子溶液之外的其余部分為純凈水。
[0015] 優(yōu)選的，所述復(fù)合生物活性因子溶液至少包括；人表皮生長(zhǎng)因子hEGF、血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子VEGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-目ITGF-目1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因 子-目2TGF-目2、類膜島素一號(hào)增長(zhǎng)因子IGF-1、類膜島素二號(hào)增長(zhǎng)因子IGF-2、角質(zhì)細(xì)胞生 長(zhǎng)因子KGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子PDGF。
[001引優(yōu)選的，所述預(yù)凍的目標(biāo)溫度為-30--5(TC，時(shí)長(zhǎng)為1-2小時(shí)；
[0017] 所述加強(qiáng)預(yù)凍的目標(biāo)溫度為-30 - -5(TC，時(shí)長(zhǎng)為1-2小時(shí)。
[0018] 優(yōu)選的，所述升華干燥包含H個(gè)階段，其中，第一階段的目標(biāo)溫度為-2(TC--1(TC，時(shí)長(zhǎng)為5-8小時(shí)，真空度為150-300mT ;第二階段的目標(biāo)溫度為-5°C -5°C，時(shí)長(zhǎng) 為1-3小時(shí)，真空度為100-250mT ;第立階段的目標(biāo)溫度為5°C -15。時(shí)長(zhǎng)為1-3小時(shí)， 真空度為50-150mT ;所述解析干燥的目標(biāo)溫度為2(TC -30。時(shí)長(zhǎng)為3-6小時(shí)，真空度為 lO-lOOmT。
[0019] 優(yōu)選的，所述保護(hù)劑還包括3-5份的氨基酸，其中，所述多元醇包括山梨醇或甘露 醇中的一種或兩種；所述氨基酸包括甘氨酸或谷氨酸的一種或兩種；
[0020] 優(yōu)選的，所述保護(hù)劑還包括1-3份的聚合物，其中，所述多元醇包括山梨醇或甘露 醇中的一種或兩種；所述聚合物包括聚己帰化咯焼麗PVP、右旋糖巧、聚己二醇和明膠中的 一種或多種。
[0021] 優(yōu)選的，所述保護(hù)劑還包括0. 5-1份的糖和0. 4-1份的聚合物；其中，所述多元醇 包括山梨醇或甘露醇中的一種或兩種；所述聚合物包括聚己帰化咯焼麗PVP、右旋糖巧、聚 己二醇和明膠中的一種或多種；所述糖包括葡萄糖、乳糖、藏糖、和海藻糖中的一種或多種。
[0022] 另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供一種復(fù)合生物活性因子凍干粉，所述復(fù)合生物活性 因子凍干粉的配方包括：5-10份多元醇，W及0. 005-0.0 l份的復(fù)合生物活性因子，所述復(fù) 合生物活性因子至少包含；人表皮生長(zhǎng)因子hEGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF、成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子FGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-目lTGF-目1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-目2TGF-0 2、類膜島素一號(hào)增長(zhǎng) 因子IGF-1、類膜島素二號(hào)增長(zhǎng)因子IGF-2、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子 PDGF。
[0023] 優(yōu)選的，所述復(fù)合生物活性因子凍干粉的配方還包括3-5份的氨基酸和1-3份的 聚合物，其中，所述多元醇包括山梨醇或甘露醇中的一種或兩種；所述氨基酸包括甘氨酸或 谷氨酸的一種或兩種；所述聚合物包括聚己帰化咯焼麗PVP、右旋糖巧、聚己二醇和明膠中 的一種或多種。
[0024] 優(yōu)選的，所述復(fù)合生物活性因子凍干粉的配方還包括0. 5-1份的糖和0. 4-1份的 聚合物，其中，所述多元醇包括山梨醇或甘露醇中的一種或兩種；所述聚合物包括聚己帰化 咯焼麗PVP、右旋糖巧、聚己二醇和明膠中的一種或多種；所述糖包括葡萄糖、乳糖、藏糖、 和海藻糖中的一種或多種。
[00巧]本發(fā)明實(shí)施例提供的一種復(fù)合生物活性因子的凍干方法，通過(guò)選擇有效的保護(hù) 劑，并合理配置保護(hù)劑與復(fù)合生物活性因子溶液的配比，然后通過(guò)預(yù)凍、加強(qiáng)預(yù)凍、升華干 燥和解析干燥處理，獲得復(fù)合生物活性因子凍干粉，該方法工藝簡(jiǎn)單，成本合理，整個(gè)凍干 周期僅需要15-20小時(shí)，且所得復(fù)合生物活性因子凍干粉所含的生物活性因子的活性可W 保持70-80%，并且可冷藏或是室溫保存1-2年，極大地改善了保存條件的要求。
[0026] 本發(fā)明實(shí)施例提供的復(fù)合生物活性因子凍干粉，包含9種生物活性因子和凍干保 護(hù)劑，可W有效的與皮膚細(xì)胞發(fā)生作用，促進(jìn)上皮細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)代謝，預(yù)防皮膚受到紫外線、 自由基等侵害，還可W促使真皮層膠原細(xì)胞的增生。因此對(duì)皮膚術(shù)后可W加速修復(fù)，并具有 撫平細(xì)紋，延緩皮膚老化等功能。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述 中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些 實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可W根據(jù)送些附 圖獲得其它的附圖。
[0028] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例所得的凍干曲線圖；
[0029] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中利用基因表達(dá)方式檢測(cè)復(fù)合生物活性因子凍干前和凍干 后的生物活性的檢測(cè)結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 現(xiàn)將詳細(xì)地提供本發(fā)明實(shí)施方式的參考，其一個(gè)或多個(gè)實(shí)例描述于下文。提供每 一實(shí)例作為解釋而非限制本發(fā)明。實(shí)際上，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯而易見(jiàn)的是，可W對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行多種修改和變化而不背離本發(fā)明的范圍或精神。例如