含有大分子的、引入有細(xì)胞穿透肽的藥物輸送載體的制作方法
【專利說明】含有大分子的、引入有細(xì)胞穿透化的藥物輸送載體
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2015年10月15日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?0-2014-0139024的韓國(guó)申請(qǐng)， W及2015年9月15日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?0-2015-0130127的韓國(guó)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，并且基于 35U. S. C. § 119要求由此產(chǎn)生的所有益處，其全部?jī)?nèi)容通過參考引入此處。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及含有大分子的、引入有細(xì)胞穿透膚的藥物輸送載體。
【背景技術(shù)】
[0004] 通常，親水性和大的物質(zhì)不能通過細(xì)胞膜屏障穿透細(xì)胞。細(xì)胞膜防止大分子，如 膚、蛋白質(zhì)和核酸進(jìn)入細(xì)胞。即使當(dāng)它們通過稱為細(xì)胞膜受體的內(nèi)吞作用的生理機(jī)理而進(jìn) 入細(xì)胞時(shí)，在與溶酶體腔融合后，它們也會(huì)被降解。因此，利用它們治療和預(yù)防疾病還存在 很多障礙。
[0005] 因此，需要并且有必要開發(fā)能夠有效將生物分子輸送至細(xì)胞內(nèi)，并且沒有細(xì)胞毒 性的新系統(tǒng)。目前已經(jīng)出現(xiàn)幾種方案。具體地，細(xì)胞穿透膚引起很大的關(guān)注是因?yàn)樗鼈兛?改善大分子的利用值，該大分子為例如由于低的細(xì)胞膜透過性和短的體內(nèi)半衰期而難W用 作藥物的治療性蛋白質(zhì)和基因。
[0006] 能夠穿透進(jìn)入細(xì)胞膜的膚主要為源自蛋白質(zhì)的膜穿透膚，可大致分為=類。第一 類為penetratin，一種源自氨基酸序列為SEQ ID NO 2的同源結(jié)構(gòu)域的膚值roso地ila melanogaster,氨基酉《序列：Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Met Lys Trp Lys Lys)。它是在控制觸角的基因（Antennapedia)的同源結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的，其是果蛹的 同源蛋白（A. Joliot et al., Proc.化 tl. Acad. Sci. U.S. A., (1991)88, 1864)。同源蛋白是 一種轉(zhuǎn)錄因子，且具有稱為含有大約60個(gè)結(jié)合至DNA的氨基酸的同源結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。第 二類為位于Tat蛋白的殘基49-57之間的化t49 57膚，Tat蛋白是一種導(dǎo)致獲得性免疫缺 陷綜合癥（AID巧的人類免疫缺陷病毒類型UHIV-1)的轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白。它具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列（人類免疫缺陷病毒類型1，氨基酸序列：Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg) (P. A. Wender et al.，PNAS (2000) 97, 24, 13003-13008)。第S類為基于膜轉(zhuǎn)位序 列（MT巧或信號(hào)序列的膚。發(fā)現(xiàn)它由受體蛋白識(shí)別，受體蛋白幫助將由RNA新和成的蛋白 質(zhì)定位在合適的細(xì)胞器官的膜上，W及結(jié)合至核定位信號(hào)（化巧的MTS穿過細(xì)胞膜并在一 些細(xì)胞類型的細(xì)胞核內(nèi)積累。運(yùn)是在源于結(jié)合至NLS膚的信號(hào)序列，例如卡波西肉瘤成纖 維細(xì)胞生長(zhǎng)因子UK-FGF)、人0 3整合素、HIV-I甜41等的疏水區(qū)內(nèi)識(shí)別的，其中化S膚源 自核轉(zhuǎn)錄因子K B (NF-KB)、猿猴病毒40 (SV40) T抗原、或K-FGF燈.Lin et al.，J. Biol. Chem. (1996)271,5305 ;X. Lin et al.，Proc.化tl. Acad. Sci. U.S. A. (1996)93, 11819 ; M.C. Morris et al. Nucleic Acids Res. (1997)25, 2730 ;L. Zhang et al.Proc.化tl. Acad. Sci. U. S. A. (1998)95, 9184 ；Chaloin et al. , Biochiem. Biochim. Res. Commun. (1998) 243, 601 ;Y. Lin et al.，J. Biol. Chem. (1995) 270, 14255)。
[0007] 相關(guān)技術(shù)參考文獻(xiàn)
[0008] 非專利文獻(xiàn)：
[0009] A. Joliot et al. , Proc.化tl. Acad. Sci. U. S. A. , (1991) 88, 1864.
[0010] P. A. Wender et al.，PNAS (2000) 97, 24, 13003-13008.
[0011] Y. Lin et al. , J. Biol. Qiem. (1996) 271, 5305.
[0012] X. Lin et al. , Proc.化tl. Acad. Sci. U. S. A. (1996) 93, 11819.
[0013] M.C. Morris et al. Nucleic Acids Res. (1997)25,2730.
[0014] L. Zhang et al. Proc.化tl. Acad. Sci. U. S. A. (1998) 95, 9184.
[0015] Qialoin et al. , Biochiem. Biochim. Res. Commun. (1998) 243, 601.
[0016] Y. Lin et al.，J. Biol. Chem. (1995) 270, 14255.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 為了容易地將不能穿透入細(xì)胞的大分子物質(zhì)輸送至細(xì)胞內(nèi)，本發(fā)明設(shè)及提供包含 細(xì)胞穿透膚和生理活性成分的組合物。
[0018] 一方面，本發(fā)明提供包含藥物輸送載體的組合物，該藥物輸送載體包含脂質(zhì)結(jié)構(gòu) 或共價(jià)鍵合至AP-GRR膚或含有細(xì)胞穿透膚的膚鏈上的聚合物顆粒，W及包封在所述載體 內(nèi)的生理活性成分。
[0019] 由于將能夠有效增加膜穿透性的AP-GRR膚引入其中，根據(jù)本發(fā)明的一方面的藥 物輸送載體顯著地改善了作為生理活性成分的、具有大分子量的大分子物質(zhì)的輸送。因此， 根據(jù)本發(fā)明一方面的藥物輸送載體克服了多糖、酶、膚、藥物、蛋白質(zhì)等大分子生理活性成 分不能很好地輸送至細(xì)胞內(nèi)的缺陷。
【附圖說明】
[0020] 圖1展示了包含本發(fā)明W及對(duì)比實(shí)施例的藥物輸送載體的脂質(zhì)體水溶液的透射 電子顯微圖像；
[0021] 圖2展示了用根據(jù)本發(fā)明一方面的攜帶巧光染料的藥物輸送載體處理細(xì)胞，并通 過FACS分析其在細(xì)胞中的含量；
[0022] 圖3展示了根據(jù)本發(fā)明一方面的攜帶羅丹明B的藥物輸送載體處理細(xì)胞，并利用 共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM)觀察細(xì)胞；
[002引圖4展示了根據(jù)本發(fā)明一方面的攜帶葡聚糖-RITC的藥物輸送載體處理細(xì)胞，并 利用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM)觀察細(xì)胞；
[0024] 圖5展示了表明在PBS或一般脂質(zhì)體中的羅丹明B和葡聚糖-RITC通過皮膚的吸 收結(jié)果的顯微圖像；
[0025] 圖6展示了表明在PBS或根據(jù)本發(fā)明一方面的藥物輸送載體中的羅丹明B和葡聚 糖-RITC通過皮膚的吸收結(jié)果的顯微圖像；
[0026] 圖7展示了通過皮膚吸收羅丹明B的定量結(jié)果；
[0027] 圖8展示了通過皮膚吸收葡聚糖-R口C的定量結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 一方面，本發(fā)明還設(shè)及一種藥物輸送載體，該藥物輸送載體包含脂質(zhì)結(jié)構(gòu)或共價(jià) 鍵合至細(xì)胞穿透膚或含有細(xì)胞穿透膚的膚鏈的聚合物顆粒。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，可將生理活性成分包封在脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中或聚合物顆粒中。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，脂質(zhì)結(jié)構(gòu)可W是脂質(zhì)構(gòu)造。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，聚合物顆?？蒞是聚合物結(jié)構(gòu)或聚合物構(gòu)造。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，生理活性成分可W具有500化或更大的數(shù)均分子量或重均 分子量。具體地，生理活性成分可W是水溶性或水不溶性大分子。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，當(dāng)藥物輸送載體包含脂質(zhì)結(jié)構(gòu)時(shí)，生理活性成分可W是水 溶性大分子。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，當(dāng)藥物輸送載體包含聚合物顆粒時(shí)，生理活性成分可W是 水不溶性大分子。
[00巧]根據(jù)本發(fā)明的一方面，細(xì)胞穿透膚可W是具有序列為Gly(Arg)。Gly Tyr Lys Cys (1《n《20)的 AP-GRR 膚。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，n可W滿足3《n《9。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，細(xì)胞穿透膚可W包含SEQ ID NO 1 (氨基酸序列：Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Tyr Lys切S)的序列。具體地，根據(jù)本發(fā)明的一 方面，細(xì)胞穿透膚可W具有沈Q ID NO 1 (Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Tyr Lys切S)的序列。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，脂質(zhì)結(jié)構(gòu)或聚合物顆?？蒞包含雙親性聚合物。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，當(dāng)聚合物顆粒進(jìn)一步包含雙親性聚合物時(shí)，該聚合物顆粒 可W是雙親性聚合物或者可W由其制備。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，細(xì)胞穿透膚或含有細(xì)胞穿透膚的膚鏈可共價(jià)鍵合至雙親性 聚合物。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，細(xì)胞穿透膚或含有細(xì)胞穿透膚的膚鏈與脂質(zhì)結(jié)構(gòu)或聚合物 顆粒之間的共價(jià)鍵可W是在馬來酷亞胺基和硫醇基之間形成的共價(jià)鍵。本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知運(yùn)種共價(jià)鍵相當(dāng)穩(wěn)定。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，細(xì)胞穿透膚或含有細(xì)胞穿透膚的膚鏈可W通過馬來酷亞胺 基和硫醇基之間的鍵鍵合至脂質(zhì)結(jié)構(gòu)、聚合物顆?；虬谄渲械碾p親性聚合物，但是并 不限于此，只要可W形成穩(wěn)定地共價(jià)鍵即可。因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明一方面的細(xì)胞穿透膚具有硫 醇基，所W可將馬來酷亞胺基引入脂質(zhì)結(jié)構(gòu)、聚合物顆?；虬谄渲械碾p親性聚合物，W 引入具有細(xì)胞穿透膚的共價(jià)鍵。根據(jù)本發(fā)明的一方面，可通過將馬來酷亞胺基鍵合至脂質(zhì) 結(jié)構(gòu)、聚合物顆粒、或包含于其中的雙親性聚合物的幾基來將馬來酷亞胺引入脂質(zhì)結(jié)構(gòu)、聚 合物顆?；虬谄渲械碾p親性聚合物。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，雙親性聚合物可W是選自具有連接至透明質(zhì)酸側(cè)鏈的烷基 化透明質(zhì)酸、化學(xué)式1的聚（甲基丙締酸-共-正烷基甲基丙締酸醋）無規(guī)共聚物、和化學(xué) 式2的聚（甲基丙締酸徑乙醋-共-正烷基甲基丙締酸醋）無規(guī)共聚物的一種或多種物質(zhì)， 但并不限于此。根據(jù)本發(fā)明一方面，雙親性聚合物可W是通過一般的自由基熱引發(fā)方法由 聚合反應(yīng)制備的一般的丙締酸醋類聚合物。
[0044]
[0045] 在化學(xué)式I和2中，
[0046] 7《n《22,和
[0047] X :y 的摩爾比為 90:10 至 50:50。
[004引根據(jù)本發(fā)明的一方面，聚（甲基丙締酸-共-正烷基甲基丙締酸醋）無規(guī)共聚物 可W由兩種單體甲基丙締酸和正烷基甲基丙締酸醋構(gòu)成。該聚合物可通過一般的自由基熱 引發(fā)方法由聚合反應(yīng)制備。同樣地，可利用陰離子或陽(yáng)離子聚合控制分子量分布。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，聚（甲基丙締酸徑乙醋-共-正烷基甲基丙締酸醋）無規(guī) 共聚物可W由兩種單體甲基丙締酸徑乙醋和正烷基甲基丙締酸醋構(gòu)成。該聚合物可通過一 般的自由基熱引發(fā)方法由聚合反應(yīng)制備。同樣地，可利用陰離子或陽(yáng)離子聚合控制分子量 分布。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，在化學(xué)式1和2中，n可W是5至30的整數(shù)，具體地為7至 22的整數(shù)，更具體地為11至22的整數(shù)。
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