6] 實施例10 CTA14S脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的制備 如實施例2中所述方法制備得到薦糖醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體。取0.5mg/mL脂質(zhì)體 CTA14S lyg，用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋到25化;取0.5mg/mL質(zhì)粒DNA 0.5yg，用無血清DMEM 培養(yǎng)基稀釋到兩稀釋液混合（脂質(zhì)體與DNA質(zhì)量比為2:1)，輕微縱滿震蕩，室溫解育 20min，得到CTA14S脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物。
[0037] 實施例11 CPA14P脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的制備 如實施例3中所述方法制備得到薦糖醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體。取1.5mg/mL脂質(zhì)體 CPA14P 3 . Oyg，用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋到25化；取O . 5mg/mL質(zhì)粒DNA O . 5yg，用無血清 DMEM培養(yǎng)基稀釋到兩稀釋液混合(脂質(zhì)體與DNA質(zhì)量比為6:1)，輕微縱滿震蕩，室溫解 育30min，得到CPA14P脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物。
[003引實施例12 CD014P脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的制備 如實施例4中所述方法制備得到陽離子脂質(zhì)體。取3.0mg/mL脂質(zhì)體CD014P 4.化g，用無 血清DMEM培養(yǎng)基稀釋到25化;取0.5yg/yL質(zhì)粒DNA 0.5yg，用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋到25y L兩稀釋液混合（脂質(zhì)體與DNA質(zhì)量比為8:1)，輕微縱滿震蕩，室溫解育40min，得到CD014P 脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物。
[0039] 實施例13陽離子脂質(zhì)體CD014S/siRNA復(fù)合物的制備 如實施例1中所述方法制備得到嵌入式陽離子脂質(zhì)體，取脂質(zhì)體Img/mL CD014S 0.地 g，用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋到取0.化g/yL SiRNAO. 3 yg，用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋 至I帖化;兩稀釋液混合(脂質(zhì)體與SiRNA質(zhì)量比為3:1)，輕微縱滿震蕩，室溫解育20min，得到 CD014S脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物。
[0040] 實施例14陽離子脂質(zhì)體/CTA14S/siRNA復(fù)合物的制備 如實施例2中所述方法制備得到嵌入式陽離子脂質(zhì)體，取脂質(zhì)體Img/mL CTA14S 0.5y g，用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋到25yレ取0.化g/yL SiRNA 0.25 yg，用無血清DMEM培養(yǎng)基稀 釋到25化;兩稀釋液混合(脂質(zhì)體與SiRNA質(zhì)量比為2:1)，輕微縱滿震蕩，室溫解育20min，得 至化TA14S /siRNA復(fù)合物。
[0041] 實施例15脂質(zhì)體結(jié)合質(zhì)粒DNA電泳延滯實驗 采用瓊脂糖凝膠電泳延滯實驗，檢測陽離子膚脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA在不同質(zhì)量比時其相 應(yīng)的電荷比情況，進(jìn)一步得出壓縮的有效比例。將陽離子膚脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA按質(zhì)量比依次 為0:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、6:1、8:1分別稀釋于15化1?^11640培養(yǎng)液中輕微縱滿震 蕩混勻，室溫解育20 min,取2化的6 XDNA Loading buffer依次加入上述15化陽離子膚 脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA復(fù)合物中混勻，并依次上樣于1.2%的瓊脂糖凝膠上樣孔中，電壓設(shè)為90 V，電泳40 min。制膠時已加入核酸染液NA-Red,電泳結(jié)束后直接在凝膠成像系統(tǒng)Gene Genius Bio-imaging System(SYNGE肥公司）中觀察DNA延滯情況。電泳結(jié)果如附圖3所示， 其中泳道1為Mark，2~9為陽離子膚脂質(zhì)體與DNA按質(zhì)量比分別為0:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、 4:1、6:巧日8:1的脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物。圖3結(jié)果顯示，隨著脂質(zhì)體質(zhì)量的增加，DNA延滯效果也 逐漸明顯，對于脂質(zhì)體〔00145、〔00140、口'4145、別41化和〔?4145，在脂質(zhì)體與0魁質(zhì)量比為 2:1時DNA已完全延滯。對于脂質(zhì)體CPA14P和CPA140,結(jié)果顯示在脂質(zhì)體與DNA質(zhì)量比為6:1 時DNA能完全被脂質(zhì)體壓縮。
[0042] 實施例16體外生物學(xué)評價實驗 (1)運(yùn)載PGFP-N2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞實驗 將化Ia細(xì)胞種植于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加細(xì)胞濃度約為1 .OX IO5個/孔，解育24 h 后，使在轉(zhuǎn)染日細(xì)胞密度達(dá)80~90%。將脂質(zhì)體與pGFP-Nl質(zhì)粒分別按照1:1，2:1，3:1，4:1，6: 1和8:1比例復(fù)合，復(fù)合后總體積為100 yL。將復(fù)合物加到細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)4-5 h，更換含 血清10%和抗生素的培養(yǎng)基，培育48 h。采用流式細(xì)胞儀檢測綠色巧光蛋白基因表達(dá)量。采 用商品化基因轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000做對照。
[0043] 實驗結(jié)果如附圖4所示，優(yōu)選的脂質(zhì)體與DNA質(zhì)量比為3:1。薦糖醋嵌入式脂質(zhì)體基 因載體均能夠運(yùn)載PGFP-Nl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染化Ia細(xì)胞。隨著助類脂薦糖醋加量逐漸增加，脂質(zhì)體基 因載體轉(zhuǎn)染效率逐漸增大;其中，CD014與S070W質(zhì)量比1:1制備的脂質(zhì)體基因載體轉(zhuǎn)染效 率與商品轉(zhuǎn)染試劑相當(dāng)。
[0044] (2) RNA干擾實驗 細(xì)胞鋪板沒有計數(shù)，取基本長滿的A549細(xì)胞，加到12孔板中，每孔加2 mL，培養(yǎng)約24 h， 細(xì)胞密度約為50-60%。每孔加入200 yL脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物，轉(zhuǎn)染18 h，換生長培養(yǎng)基培 養(yǎng)30 h。將細(xì)胞用DPBS洗1次，每孔加入600化裂解液，20 min后，移至96孔白板中，每孔加 20化，加80化普洛麥格E151A檢測液，用多功能酶標(biāo)儀(BioTek)檢測相對酶活力。取裂解 液5化加到96孔透明板中，W熱電公司的Pierce BCA Protein Assay試劑盒為標(biāo)準(zhǔn)對照 測定總蛋白含量。
[0045] 圖5選擇脂質(zhì)體與SiRNA最佳N/P比3:1，介導(dǎo)RNAi研究考察巧巾薦糖醋嵌入式陽離 子脂質(zhì)體運(yùn)載SiRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞沉默Iucif erase基因的能力。Lipof ectamine2000為陽性 對照，SiRNA和Control為空白對照。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后，Iucif erase基因的表達(dá)水平均受到不 同程度的抑制。其中，CD0140/siRNA基因載體與空白組相比，巧光素酶基因的沉默效率可達(dá) 75%。說明脂質(zhì)體介導(dǎo)SiRNA進(jìn)入細(xì)胞后可與細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)形成核酸蛋白復(fù)合物(1?^八-induced silencing complex，RISC)，在RISC的作用下，SiRNA特異識別目的mRNA，在核酸內(nèi) 切酶作用下切割目的mRNA，mRNA片段在核酸外切酶作用下降解后無法指導(dǎo)合成相應(yīng)的蛋白 質(zhì)，從而實現(xiàn)了對Iucif erase基因的沉默。
[0046] (3)細(xì)胞毒性研究(MTT比色法） 采用MTT法對轉(zhuǎn)染效率較高的陽離子脂質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗，W商品化基因轉(zhuǎn)染試 劑Lipofectamine 2000及DOTAP為對照。將化Ia及A549細(xì)胞種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 加細(xì)胞培養(yǎng)液(含雙抗和血清）1〇〇 yL，濃度約為1.0 X IO6個/孔，解育24 h，使在轉(zhuǎn)染日細(xì) 胞密度達(dá)80~90 %。移去生長培養(yǎng)基，用100化培養(yǎng)基清洗，再用等量（100化)培養(yǎng)基替換。 將脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA分別按照1:1，2:1，3:1，4:1，6:1和8:1比例復(fù)合加到細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì) 胞培養(yǎng)24 h后，每孔中加入20 yL MTT(Sigma，5 mg/mL)，解育培養(yǎng)4- 4.5 h。棄去培養(yǎng)液， 加入150 yL DMSO溶破細(xì)胞。
[0047] 基于MTT比色法的檢測原理為:活細(xì)胞線粒體中的班巧酸脫氨酶能使外源性MTT還 原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臘(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，二甲基 亞諷(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瑣，用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定其吸光值，可間接反映活細(xì) 胞數(shù)量。故此，W空白對照(未轉(zhuǎn)染細(xì)胞)的吸光值為100 %，計算轉(zhuǎn)染后細(xì)胞存活的百分率 (%)。計算公式為： 細(xì)胞存活率(％) = [4]棉。。/[4]礎(chǔ),sX 100 %
[A]樹勸測試孔的吸光值，[A]礎(chǔ).S為陰性空白對照孔的吸光值。
[0048] 實驗結(jié)果如圖6和圖7,橫坐標(biāo)為所制備的薦糖醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體，優(yōu)選的脂 質(zhì)體與DNA質(zhì)量比為3:1。圖6是采用MTT比色法檢測本發(fā)明的薦糖醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基 因載體轉(zhuǎn)染過程中對化Ia細(xì)胞毒性的檢測。圖7是采用MTT比色法檢測本發(fā)明的陽離子脂質(zhì) 體基因載體細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中對A549細(xì)胞毒性的檢測。