一種基于miRNA-34a小分子調(diào)節(jié)劑的遞送系統(tǒng)及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及納米載體材料在腫瘤治療中的應(yīng)用，具體涉及一種基于miRNA-34a小分子調(diào)節(jié)劑的納米遞送系統(tǒng)及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是嚴(yán)重危害人類生命健康的重大疾病，近年來發(fā)病率持續(xù)上升，死亡率不斷增加。原發(fā)性肝癌，簡(jiǎn)稱肝癌，其癥狀一般多不明顯，特別是在病程早期。癥狀一旦出現(xiàn)，說明腫瘤已經(jīng)較大，其病勢(shì)凋亡進(jìn)展則很迅速，通常在數(shù)周內(nèi)即呈現(xiàn)惡病質(zhì)，往往在幾個(gè)月至I年內(nèi)即衰竭死亡。常規(guī)的治療肝癌的化療藥物有5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、紫杉醇等，在治療的同時(shí)往往伴隨嚴(yán)重的毒副作用。因此，研究安全、有效的抗腫瘤藥物制劑對(duì)于肝癌的治療具有重大意義。
[0003]RNA干擾(RNA interference,RNAi)被公認(rèn)為是細(xì)胞調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)鍵機(jī)制，先后在植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。RNA干擾包括短的雙鏈或單鏈寡核苷酸，通過特定的途徑抑制基因表達(dá)，包括低等和高等生物體細(xì)胞中內(nèi)源性的micr0RNA(miRNA)、人工合成的小干擾RNA(SiRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、反義寡核苷酸(ASOS)和Piwi蛋白與siRNA的復(fù)合物(Piw1-1nteracting RNAs,piRNAs)等。
[0004]MicroRNA(miRNA)是在許多真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA。目前，大約發(fā)現(xiàn)了2000多種miRNA，它在進(jìn)化上具有保守性，在表達(dá)和功能上具有多樣性。最初發(fā)現(xiàn)miRNA在基因表達(dá)調(diào)控中起一定的作用，近年來發(fā)現(xiàn)它與腫瘤有關(guān)，它與癌癥的發(fā)生、診斷、治療和預(yù)后密切相關(guān)，在各類癌癥中均發(fā)現(xiàn)了它的作用。它的主要功能是調(diào)節(jié)生物體生長(zhǎng)、發(fā)育和疾病發(fā)生過程中有關(guān)基因的表達(dá)。已有大量的科學(xué)研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲、預(yù)后等多種過程中發(fā)揮著重要作用。某些miRNA在腫瘤細(xì)胞中特異性高表達(dá)，其升高可以刺激腫瘤發(fā)生，這些miRNA扮演了癌基因角色，使用反義核苷酸技術(shù)，能夠降低致癌miRNA表達(dá)水平，起到抑癌作用。某些miRNA在腫瘤細(xì)胞中特異性低表達(dá)，這些miRNA屬于抑癌基因，增加該類miRNA的表達(dá)，能夠起到抑癌作用。
[0005]MiRNA-34 家族包含 3 個(gè) miRNAs，分別是 miRNA-34a、miRNA-34b 和 miRNA-34c。研究表明，miRNA-34a能夠靶向調(diào)控多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白或蛋白激酶的表達(dá)，通過多種靶分子如CDK4/6、CDK2、E2F3、Fra-l、Notchl、SIRTl、Bcl-2等在腫瘤細(xì)胞增殖、周期和凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，發(fā)揮抑癌功能。因此，恢復(fù)miRNA-34a的功能被視為一條治療腫瘤的有效途徑。目前恢復(fù)miRNA-34a的功能可以有多種途徑，主要包括轉(zhuǎn)染miRNA-34a模擬物以及使用小分子化合物調(diào)節(jié)miRNA-34a的表達(dá)。核酸類miRNA模擬物的轉(zhuǎn)染效率低、易降解，限制了其在腫瘤治療中的應(yīng)用。miRNA小分子調(diào)節(jié)劑是近年來發(fā)現(xiàn)的一類小分子，其能夠調(diào)控miRNA的表達(dá)。2，-羥基-2，4，4’，5，6’_五甲氧基查爾酮，又名Rubone，是一種疏水性的miRNA_34a小分子調(diào)節(jié)劑，能夠上調(diào)miRNA-34a的表達(dá)，進(jìn)而恢復(fù)miRNA-34a對(duì)腫瘤的抑制作用。但是由于該分子的疏水性質(zhì)，并不能直接使用，使其治療作用受到限制。
[0006]為了解決疏水性小分子化合物溶解性能，納米遞送系統(tǒng)成為近年來研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。開發(fā)出能夠有效負(fù)載的遞送系統(tǒng)，遞送相關(guān)分子進(jìn)入腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞，具有重要的臨床轉(zhuǎn)化意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為解決上述問題，本發(fā)明通過制備羧甲基葡聚糖修飾的聚乙烯亞胺-聚己內(nèi)酯納米顆粒，實(shí)現(xiàn)了疏水性miRNA_34a小分子調(diào)節(jié)劑Rubone的包載與遞送；
[0008]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0009]所述的納米遞送載體為羧甲基葡聚糖修飾的聚乙烯亞胺-聚己內(nèi)酯納米膠束。本發(fā)明提供的納米膠束，能夠較高效率地包載miRNA-34a小分子調(diào)節(jié)劑Rubone，解決Rubone水溶性差的問題，改善其溶解性能。
[0010]本發(fā)明中，所述的兩親性聚合物材料為聚乙烯亞胺-聚己內(nèi)酯共聚物，其中聚乙烯亞胺的分子量為800Da，聚己內(nèi)酯分子量為20KDa。
[0011]本發(fā)明中，所述羧甲基葡聚糖為水溶性羧甲基修飾的葡聚糖衍生物，是生物相容性好、生物可降解和代謝的天然高分子材料，其取代度>50%，分子量為20-110KDa。羧甲基葡聚糖修飾的納米膠束能夠顯示出更好的生物相容性，同時(shí)能夠避免血漿中負(fù)電性蛋白的吸附，實(shí)現(xiàn)納米膠束的長(zhǎng)循環(huán)。
[0012]本發(fā)明中，所述聚合物膠束負(fù)載的活性成分為可以調(diào)節(jié)miRNA_34a表達(dá)的小分子調(diào)節(jié)劑Rubone，分子量為374.39的疏水性小分子化合物。
[0013]本發(fā)明中，miRNA-34a小分子調(diào)節(jié)劑與兩親性嵌段共聚物的質(zhì)量比為1: 5?1: 20，優(yōu)選為1:20。
[OOM]本發(fā)明中，羧甲基葡聚糖修飾的納米膠束包載Rubone的制備方法，包括以下步驟:
(1)將miRNA-34a小分子調(diào)節(jié)劑和聚乙烯亞胺-聚己內(nèi)酯兩親性嵌段共聚物溶于有機(jī)溶劑中，制得有機(jī)相；
(2)將含有乳化劑的水相加入到上述有機(jī)相中，渦旋，然后超聲制得水相和有機(jī)相的混合物；
(3)將水相和有機(jī)相的混合物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)溶劑；
(4)將除去有機(jī)溶劑的溶液離心，即得負(fù)載Rubone的聚乙烯亞胺-聚己內(nèi)酯聚合物膠束沉淀；
(5)沉淀用分散溶液復(fù)溶，即得負(fù)載Rubone的聚乙烯亞胺-聚己內(nèi)酯聚合物膠束溶液；將最終得到的膠束溶液凍干、稱量，計(jì)算產(chǎn)量;重新將產(chǎn)物溶解于超純水中，制備成lmg/mL的水溶液；
(6)用pH= 7.4磷酸鹽緩沖溶液制備10mg/mL的羧甲基葡聚糖溶液，并過0.22μηι的微孔濾膜；
(7)將ImL上述(5)中分散膠束溶液，滴加到ImL、10mg/mL的羧甲基葡聚糖水溶液中，使用磁力攪拌器持續(xù)攪拌30min，放置穩(wěn)定，離心，去除上清液，分散，用超純水復(fù)溶，即得包載Rubone的羧甲基葡聚糖修飾的聚乙稀亞胺-聚己內(nèi)酯膠束。
[0015]其中，步驟(I)中，所用有機(jī)溶劑選自氯仿、甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷，上述溶劑可單獨(dú)或者混合使用;本發(fā)明所述有機(jī)溶劑優(yōu)選氯仿。
[0016]步驟(2)中，加入2mL?6mL、0.5%?2%乳化劑，渦旋5s?60s秒，超聲Imin?1min分鐘。
[0017]步驟(3)中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸1min?30min除去有機(jī)溶劑。
[0018]步驟(4)中，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為8000rpm?12000rpm，離心時(shí)間5min?30min。
[0019]步驟(5)中，所用分散溶液為去離子水或磷酸鹽緩沖溶液。
[0020]本發(fā)明所用試劑盒原料均市售可得;對(duì)于本發(fā)明中沒有具體描述的裝置、條件(溫度、時(shí)間等)、物質(zhì)、用量、方法等，均可采用本領(lǐng)域已知的或本領(lǐng)域技術(shù)人員按照常規(guī)技術(shù)可確定的。
[0021]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述聚合物膠束制劑在治療肝癌中的應(yīng)用。體外細(xì)胞水平驗(yàn)證了包裹Rubone的納米遞送系統(tǒng)能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞HepG-2的增殖。進(jìn)一步通過裸鼠肝癌腫瘤移植模型驗(yàn)證了尾靜脈注射該納米膠束，能夠顯著抑制肝癌的生長(zhǎng)。
[0022]本發(fā)明的包載Rubone的羧甲基葡聚糖修飾的聚乙烯亞胺-聚己內(nèi)酯納米膠束具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0023]1.選用的兩親性嵌段共聚物聚合物材料無毒，在體內(nèi)可生物降解和代謝，具有良好的生物相容性;選用的羧甲基葡聚糖具有很好的生物相容性和生物可降解性，并且?guī)ж?fù)電性，能夠顯著抵抗血漿中負(fù)電性蛋白的吸附，提高尾靜脈系統(tǒng)給藥過程中血漿中納米膠束的穩(wěn)定性