一種薄荷葉抗氧化活性有效部位及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，設(shè)及薄荷葉抗氧化活性有效部位及其制備方法，還設(shè)及 薄荷葉抗氧化活性部位在制備抗氧化保健產(chǎn)品中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 自由基是人體疾病和衰老的直接制造者，人壽命的長短與自由基的產(chǎn)生及人體內(nèi) 抗氧化劑的濃度有著密切的關(guān)聯(lián)。增加抗氧化劑的攝入量可有效降低癌癥高發(fā)人群的發(fā)病 率。然而研究發(fā)現(xiàn)，合成的抗氧化劑對人體具有潛在的威脅，因此，研究開發(fā)廣譜、高效、安 全的天然抗氧化劑已成為當今研究的熱點之一。
[0003] 中草藥資源是我國寶貴的財富，很多中草藥都含有豐富的抗氧化成份，薄荷 (M. canadensis L.)是唇形科化abia1:ae)薄荷屬(Mentha L.)植物，為我國傳統(tǒng)中藥，近年 來研究發(fā)現(xiàn)，其中富含多種對人體健康有益的物質(zhì)表現(xiàn)出良好的抗氧化能力[She G，Xu C, Liu B, et al. J Food Sci, 2010，75(4): C359-C362]。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻檢索發(fā) 現(xiàn)，國外對抗氧化活性研究多集中于該屬的其他種如留蘭香M. spicata和椒樣薄荷M. X piperita等，該種在我國則作為中藥薄荷偽品不能用于藥材流通。而國內(nèi)對薄荷研究多集 中于揮發(fā)性成分中，對于葉片中非揮發(fā)性成分的抗氧化活性少有報道。在對我國傳統(tǒng)藥食 同源中藥綜合利用其非揮發(fā)性成分研究發(fā)現(xiàn)其提取物具有良好的抗氧化活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本案發(fā)明人在發(fā)現(xiàn)薄荷葉提取物具有潛在的抗氧化活性的基礎(chǔ)上在體外抗氧化 活性的指導下，研究了該有效部位的提取方法，并從該部位中獲得了主要化學成分的分離 純化。
[000引本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種物質(zhì)基礎(chǔ)明確、活性與機制清晰的 薄荷葉抗氧化活性有效部位及該有效部位的制備方法和其在抗氧化保健產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0006] 為了達到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為： 薄荷干燥葉片25kg，用50-70 %乙醇按料液比1:5-1:8,常溫浸提15-20 d，連續(xù)提取2-3 次，濾過后合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏，加水使成為混懸液，正下醇萃取4 次，合并提取液，減壓回收，得正下醇部位約500g，經(jīng)打孔樹脂HPD-600色譜分離，用水洗脫 至無色，再用70%乙醇洗脫后收集洗脫液，濃縮干燥獲得薄荷葉抗氧化有效部位。
[0007] 本發(fā)明采用DPPH、ABTS兩種抗氧化模型體外評價確定該有效部位抗氧化活性。 DPPH自由基清除中EC50值越小說明清除率越高，正下醇部位顯著高于其他部位。ABTS實驗 表明正下醇EC50值為4.93 ± 0.25。
[000引表1薄荷不同溶劑提取物對DPPH自由基清除的EC50值(P<0.05)
本發(fā)明的薄荷葉抗氧化有效部位中主要成分包括咖啡酸、原兒茶酸、熊果酸、坡莫酸、 香木葉素、2a，3a-二徑基-12締-28-烏簇酸、2a-徑基齊墳果酸、迷迭香酸、刺槐素-7-O-0-D-葡萄糖巧、木犀草素、木犀草素-7-O-0-D-葡萄糖巧。
[0009] 本發(fā)明的薄荷葉抗高尿酸血癥有效部位制備方法優(yōu)點為工藝簡單，操作方便，技 術(shù)易掌握，能耗小，溶劑可回收循環(huán)使用，生產(chǎn)成本低。
[0010] 本發(fā)明的薄荷葉抗氧化有效部位在制備薄荷保健產(chǎn)品中應(yīng)用，特別是在制備抗氧 化保健產(chǎn)品中應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明還提供用本發(fā)明的薄荷抗氧化有效部位W及保健食品上可接受的載體或 賦形劑制備的藥物制劑。運些藥物制劑選自W下劑型:片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣 片劑、泡騰片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、微球劑、顆粒劑、丸劑、散劑、膏劑、口 服液、混懸劑、溶液劑、凍干粉。
[0012] 本發(fā)明的含有薄荷葉抗氧化有效部位保健品制劑，在制備制劑時可加入可接受的 載體，所述載體來自：抗氧劑、塞合劑、表面活性劑、填充劑、崩解劑、濕潤劑、溶劑、緩釋材 料、腸溶材料、pH調(diào)節(jié)劑、矯味劑、色素等，常用載體如:甘露糖醇、右旋糖巧、乳糖、葡萄糖、 山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化鋼、娃衍生物、纖維素、纖維素衍生物、明膠、聚 乙締化咯燒酬、甘油、吐溫80、瓊脂、碳酸巧、聚乙二醇、環(huán)糊精、憐脂類材料、滑石粉、硬脂酸 儀、硬脂酸巧等。
【附圖說明】
[0013] 圖1、2本發(fā)明采用現(xiàn)代分離鑒定技術(shù)對抗氧化有效部位化學成分進一步分離鑒定 得到各化合物結(jié)構(gòu)圖。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1 薄荷葉抗氧化活性部位的提取與分離：薄荷干燥葉片25kg，用70 %乙醇按料液比1:5， 常溫浸提15-20 d，連續(xù)提取3次，濾過后合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏，加水 使成為混懸液，正下醇萃取4次，合并提取液，減壓回收，得正下醇部位約500g，經(jīng)打孔樹脂 HPD-600色譜分離，用水洗脫至無色，再用70%乙醇洗脫后收集洗脫液，濃縮干燥獲得薄荷葉 抗氧化有效部位。
[001引實施例2 體外抗氧化活性測定:清除DPPH自由基實驗，、取不同提取物，DMSO溶解，配制成IOmg/ mL母液。DPPH用無水乙醇配制成0.16mmol/L，置于棟色瓶中備用。在96孔板中，每孔分別入 20化不同濃度的樣品溶液、8化L超純水和I(K)化的0.16mmol/L DPPH，反應(yīng)體系20化L。加 樣后室溫避光振蕩15min，將96孔板放入酶標儀中在517nm波長處檢測樣品的吸光度(Ai); 取20 ml DMSO代替樣品溶液測得空白吸光度(AO) ; W10化L無水乙醇代替DPPH溶液測得樣 品本底吸光度(Aj);每個濃度做4個平行對照，取其平均值。WVC做陽性對照，按公式（1)計 算清除率，并計算EC50值。
[0016]
表1薄荷不同溶劑提取物對DPPH自由基清除的EC50值(P<0.05)
清除ABTS自由基實驗ABTS混合液的制備：將7mmol/L ABTS水溶液與2.45mmol/L過 硫酸鐘水溶液(終濃度)混合，將混合液在室溫避光條件下放置12~1化，形成ABTS儲備液。將 此工作液與乙醇按照約1:20(v/v)比例混合，在734nm下調(diào)吸光度為0.700 ±0.02即得，于 30°C下預(yù)熱備用。在96孔板中，每孔分別入10化不同濃度的樣品溶液和19化L ABTS混合液， 反應(yīng)體系20化L。反應(yīng)10s，靜置IOmin，將96孔板放入酶標儀中在734nm波長處檢測樣品的吸 光度(Ai );取10化DMSO代替樣品溶液測得空白吸光度(Ao); W19化L無水乙醇代替ABTS混 合液測得樣品本底吸光度(Aj );每個濃度做4個平行，取其平均值。W Vc做陽性對照，按公式 (1)計算清除率，并計算ECso值。
[0017]表2薄荷不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除的ECso值(P<0.05)
實施例3 薄荷葉抗氧化有效部位化學成分的分離與鑒定： 薄荷葉抗抗氧化有效部位經(jīng)ODS柱色譜和制備液相色譜分離得到10個化合物，利用 MS、iH-NMR、Uc-NMR數(shù)據(jù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)為:搬皮素（1)、原兒茶酸(2)、熊果酸(3)、坡莫酸 (4)、香葉木素巧）、化，3a-二徑基-12締-28-烏簇酸(6)、化-徑基齊墳果酸（7)、咖啡酸(8)、 迷迭香酸(9)、刺槐素-7-O-0-D-葡萄糖巧（10)、木犀草素（11)、木犀草素-7-O-0-D-葡萄糖 巧（11)。其中原兒茶酸、香葉木素、木犀草素、木犀草素-7-O-0-D-葡萄糖巧首次在薄荷中分 離得到，坡莫酸、2a，3a-二徑基-12締-28-烏簇酸、2a-徑基齊墳果酸、刺槐素-7-O-0-D-葡萄 糖巧首次在薄荷屬植物中分離得到。
[001 引 化合物1:黃色粉末誠60的，]?8 111八：302.04([]\?1] + )。1護醒1?(0150,5001化）5: 12.47(1H, S, 5-OH), 10.76(1H, s, H-7), 9.39(1H, s, H-3), 8.52(2H, d, J=8.5, H-3'，4')， 7.64(1H， d, J=2Hz, H-2')， 7.52(1H， d, J=2Hz H-6')， 6.78(1H， s, H), 6.42(lH，s，H)，6.21(lH，s，H);UC-NMR(DMS0，125MHz)S:174.81(C-4)，162.53(C-7)，160.04(05)，156.31(09)，147.52(C-4'），146.82(02)，144.83(C-3'），135.48 (C-3), 121.91(C-r), 119.83(C-6，），115.54(C-5，），115.24(C-2，），104.39(010)， 98.3KC-6), 92.9(C-8)〇
[0019] 化合物2:白色針狀結(jié)晶誠6〇於，]\18 111八：155.12([]\?1] + )。1護醒1?化2〇,5001化） 5:7.42(lH，d，J=2HzH-2)，7.39(lH，d，J=8HzH-6)，7.37(lH，d，J=8HzH-5);UC-NMR(D20, 125MHz)S: 177.03(07)，150.03(03)，146.03(04)，131.30(01)，124.24 (C-6), 119.63(05)，118.11(02)。
[0020] 化合物3:白色粉末(MeOH)，mp:272-273°C;MS m/z: 457.37([M+H] + )，故而推斷 其分子式為C3〇H48〇3 eUc-NMR(PYR, 125MHz)S: 179.88(028)，139.28 (C-13), 125.66 (C-12), 78.14(03)，55.84(05)，53.57(018)，48.06(09,17)，42.52(014)， 39.99(C-8), 39.51(019)，39.42(C-4), 39.39(C-1), 39.10(020)，37.46(010)， 37.30(C-22), 33.60(C-7), 31.09(C-21), 28.83(C-23), 28.71 (C-15), 28.15 (C-2), 24.93(016)，23.93(027)，23.65(011)，21.43(030)，18.80(C-6), 17.54(029)， 17.47(026)，16.59(025)，15.70(024)。
[0021 ]化合物4:白色粉末(MeOH)，MS m/z: 495.34([M+化]+ )dUc-NMR(PYR, 125 MHz) S: 180.77(028)，139.66(013)，127.83(012)，78.09(03)，72.51(019)，55.65 (C-5), 54.37(018)，48.11(017)，47.53(C-9), 42.14(020)，41.83(014)，40.09 (C-8), 39.1KC-4), 38.80(C-1), 38.27(C-22), 37.OS(C-IO), 33.33(C-7), 29.06(C- 15) , 28.56(C-23), 27.67(C-2), 26.90(C-21), 26.68(C-29), 26.13(C-16), 24.48(C-27)，23.78(011)，18.69(