垂絲海棠提取物和活性化合物、制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥和/或保健品技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種垂絲海棠提取物和從垂絲 海棠花中分離得到的活性化合物、制備方法，W及其在抗凝血方面的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 垂絲海棠 (Malus halliana Koehne)是菩薇科蘋果屬植物。垂絲海棠，氣微，味微 苦、澀，性平，歸肝經(jīng)，有調(diào)經(jīng)和血的功效，主要用于治療血崩。垂絲海棠與同科的貼梗海棠 (C. speciosa)、西府海棠（M. micromalus)和木瓜海棠（C. cathayensis)并稱"海棠四 品"。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn):垂絲海棠具有保肝、抗氧化、體外抑制Q-葡萄糖巧酶活性，而且垂絲海 棠花、葉和果實(shí)中都有一定的活性成分，藥用價(jià)值較高。但對(duì)垂絲海棠的研究主要集中在園 林美化、栽培繁育、保健飲料、生物活性方面，化學(xué)成分僅見脂溶性成分的報(bào)道。
[0003] 血液凝固簡(jiǎn)稱凝血，是在內(nèi)源性或（和）外源性凝血途徑下產(chǎn)生凝血酶原激活物， 凝血酶原激活物在凝血因子的作用下產(chǎn)生凝血酶，最后凝血酶使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋 白，血液由溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)。凝血過(guò)程通常分為:①內(nèi)源性凝血途徑;②外源性凝 血途徑;③共同凝血途徑。外源性凝血途徑是從組織因子暴露于血液而啟動(dòng)，到因子X被激 活的過(guò)程；臨床上W凝血酶原時(shí)間（PT)測(cè)定來(lái)反映外源性凝血途徑的狀況。內(nèi)源性凝血途 徑是指從因子XII激活，到因子村敦活的過(guò)程；臨床上W活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT)來(lái)反 映體內(nèi)內(nèi)源性凝血途徑的狀況。從因子X被激活至纖維蛋白形成，是內(nèi)、外源共同凝血途徑； 主要包括凝血酶生成和纖維蛋白形成兩個(gè)階段。
[0004] 血栓形成是許多疾病如屯、肌梗死、缺血性卒死、深靜脈血栓等的基本病理過(guò)程，它 嚴(yán)重地危害著人類的健康，它的形成與血小板的聚集、粘附，內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)W及 纖維蛋白的形成密切相關(guān)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的調(diào)查報(bào)告，由于動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的血栓 疾病引起的死亡已經(jīng)排到了第一位。動(dòng)脈血栓是由于動(dòng)脈粥樣硬化，斑塊不穩(wěn)定發(fā)生了斑 塊的破裂，使血液里的血小板發(fā)生聚集，激活了體內(nèi)的凝血系統(tǒng)，最后導(dǎo)致血栓形成。一旦 堵塞W后就會(huì)發(fā)生組織的缺血和壞死，產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。在動(dòng)脈血栓性疾病的急性或特殊 狀態(tài)下，需要輔助使用抗凝血藥物，才能達(dá)到更好的抗血栓效果。
[000引目前，尚無(wú)垂絲海棠花提取物和化合物寶蕾巧n、山奈酪-3-0-aA-巧喃阿拉伯糖 巧、根皮素-4'-0-葡萄糖巧、山奈酪-3-0-0寸-鼠李糖巧對(duì)家兔體外血漿凝血四項(xiàng)影響的報(bào) 道。本發(fā)明通過(guò)測(cè)定垂絲海棠花提取物和化合物對(duì)凝血四項(xiàng)的影響，考察其體外抗凝血作 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種垂絲海棠提取物和從垂絲海棠花中 分離得到的活性化合物、制備方法，W及其在制備抗凝血藥物方面的新用途。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種垂絲海棠提取物的制備方法，其W垂絲海棠花為原料，將陰干的垂絲海棠花用70% 乙醇浸潰提取2-4次，每次2-4 d，提取液濃縮得到垂絲海棠花總浸膏;將垂絲海棠花總浸 膏用甲醇溶解，D-IOl型大孔樹脂拌樣、裝柱，依次用水、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、甲醇梯 度洗脫，每個(gè)濃度梯度洗脫5個(gè)柱體積，每個(gè)柱體積2000 mL，濃縮，分別得到水部位浸膏、 20%甲醇部位浸膏、40%甲醇部位浸膏、60%甲醇部位浸膏、甲醇部位浸膏。垂絲海棠提取物即 為垂絲海棠花總浸膏、40%甲醇部位浸膏、60%甲醇部位浸膏和甲醇部位浸膏中的一種或兩 種W上的混合物。
[000引一種從60%甲醇部位浸膏中分離垂絲海棠活性化合物的方法，其將上述的60%甲醇 部位浸膏進(jìn)行200-300目硅膠柱色譜分離，依次用體積比為100:0、90:10、80: 20、70: 30、 60:40、50: 50的二氯甲燒乙酸乙醋混合液、W及體積比為10:0、9:1、8: 2的二氯甲燒甲醇混 合液進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜進(jìn)行檢測(cè)，相同成分合并，共得到11個(gè)組分;其中的第4組分經(jīng) 過(guò)反復(fù)的硅膠柱色譜和凝膠柱色譜分離得到化合物1、2和4;其中的第6組分經(jīng)過(guò)中壓制備 液相色譜、硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離得到化合物3。垂絲海棠花活性化 合物即為化合物1、2、3和4中的一種或兩種W上的混合物。其中，化合物1、2、3、4分別為寶蕾 巧n、山奈酪-3-0-曰寸-巧喃阿拉伯糖巧、根皮素-4 ' -0-葡萄糖巧、山奈酪-3-0-aA-鼠李糖 巧(4)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0009] 采用上述方法制備得到的垂絲海棠提取物。
[0010] 采用上述方法制備得到的垂絲海棠活性化合物。
[0011] 上述垂絲海棠提取物在制備抗凝血藥物方面的應(yīng)用。
[0012] 述垂絲海棠活性化合物在制備抗凝血藥物方面的應(yīng)用。
[0013] 上述垂絲海棠提取物和垂絲海棠活性化合物聯(lián)合使用用于制備抗凝血藥物。
[0014] 和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明提供具有活性化合物的來(lái)源植物垂絲海棠，其為菩薇科植物垂絲海棠 Malus halliana花。本發(fā)明從垂絲海棠花提取獲得各部位，且從60%甲醇部位中進(jìn)一步分離得到四 個(gè)化合物，并對(duì)垂絲海棠花各部位和活性化合物的體外抗凝血效果進(jìn)行考察。結(jié)果表明：垂 絲海棠花各部位和化合物1-4均具有良好的抗凝血效果，且垂絲海棠花總浸膏抗凝血效果 比燈盞花素好?？梢姡鼈兛蒞單獨(dú)或組合用于抗凝血?jiǎng)?br>【附圖說(shuō)明】
[001引圖巧垂絲海棠花棘性化合物中化合物1-4的結(jié)構(gòu)式； 圖2為凝血機(jī)制圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳細(xì)介紹，但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不局限于此。
[0017] 下述實(shí)施例中所用垂絲海棠花采集于河南大學(xué)金明校區(qū)，為菩薇科蘋果屬植物垂 絲海棠 Malus halliana花。
[0018] 實(shí)施例1垂絲海棠花提取物及活性化合物的提取分離 一種垂絲海棠提取物的制備方法，其W垂絲海棠花為原料，將陰干的垂絲海棠花用 70V%乙醇浸潰提取3次，每次3 d，提取液合并、過(guò)濾、濃縮得到垂絲海棠花總浸膏。取部分垂 絲海棠花總浸膏用甲醇溶解，D-IOl型大孔樹脂柱色譜分離，依次用水、20V%甲醇、40V%甲 醇、60V%甲醇、甲醇梯度洗脫，每個(gè)濃度梯度洗脫5個(gè)柱體積，每個(gè)柱體積2000 mL，濃縮，分 別得到水部位浸膏、20%甲醇部位浸膏、40%甲醇部位浸膏、60%甲醇部位浸膏、甲醇部位浸 膏。
[0019] -種從60%甲醇部位浸膏中分離垂絲海棠活性化合物的方法，具體為：將上述的 60%甲醇部位浸膏進(jìn)行200-300目硅膠柱色譜分離，依次用體積比為100:0、90:10、80: 20、 70:30、60:40、50:50的二氯甲燒乙酸乙醋混合液、^及體積比為10:0、9:1、8:2的二氯甲燒 甲醇混合液進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜進(jìn)行檢測(cè)，相同成分合并，共得到11個(gè)組分;其中的第4 組分經(jīng)過(guò)反復(fù)的硅膠柱色譜和凝膠柱色譜分離得到化合物1、2和4;其中的第6組分經(jīng)過(guò)中 壓制備高效液相色譜、硅膠柱色譜、S巧hadex LH-20凝膠柱色譜分離得到化合物3。
[0020] 運(yùn)用多種譜學(xué)技術(shù)鑒定化合物1、2、3和4的結(jié)構(gòu)，結(jié)果如下： 寶蕾巧n(l):黃色結(jié)晶（甲醇），mp 156~158VH-NMR (CD3〇H，400Hz) 5:0.77 (3H，d, J=4Hz，rha-Me)，5.70 (lH，s，rha-l)，1.37 (3H，s，H-5")，1.44 (3H，s，H-4")，4.51 (lH，d, J=4Hz，H-2")，3.29 (2H，s，H-r)，6.37 (lH，s，H-6)，6.92 (2H，d，J=8Hz，H-3'，5'） ，7.78 (2H，d，J^Hz，H-2'，6'）；UC-NMR(CD3〇H，100Hz)S:159.3(C-2)，135.4(C-3)，179.5(C-4),163.2 (C-5)，95.0 (C-6)，165.9 (C-7)，105.9 (C-8)，158.6 (C-9)，99.9 (C-10)， 122.6 (C-r)，131.9 (C-2，，6，），116.5 (C-3，，5，），161.7 (C-4，），99.7 (rha-l)，74.7 (rha-2)，77.2 (rha-3)，79.5 (rha-4)，69.5 (rha-5)，17.0 (rha-6)，26.5 (C-r)，110.3 (C-2")，131.9 (C-3")，28.3 (C-4")，17.0 (C-5")。
[0021 ] 山奈酪-3-0-a-k^喃阿拉伯糖巧(2):淺黃色粉末，溶于甲醇，mp 230~23rCeEI- MS m/z:419[M+l]\iH-NMR (DMSO-ds,400Hz) 5:5.59,5.35,4.74,4.14,3.61,3.28,3.16 (糖的-CH和-OH信號(hào)），6.20(1H, d, J=4Hz, H-6)，6.45 (IH, d, J=4Hz, H-8)，6.88 (2H, d，J=8.0Hz，H-3'，5')，8.00(2H，d，J=8.0Hz，H-2'，6')，12.62(lH，s，5-OH);UC-NMR(DMS0-d6，100Hz)S:156.6(C