裸花紫珠顆粒在抗腸病毒方面的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，具體設及裸花紫珠顆粒的新應用。
【背景技術】
[0002] 裸花紫珠（Callica;rpa nudiflora Hook.et Arn.)為馬鞭草科（Verbenaceae)紫 珠屬植物，主產于我國海南，是一種海南地道藥材，我國廣東、廣西也有分布。目前有研究表 明裸花紫珠藥材的主要成分為黃酬類、較質、祗類、揮發(fā)油類等，其中祗類和黃酬能增加血 小板的數量，縮短出血和凝血時間，對纖溶系統(tǒng)具有顯著的抑制作用，收縮血管、止血效果 顯著，對炎癥早期的滲出、腫脹有明顯的抑制作用，加快創(chuàng)面滲出的吸收，促進傷口的愈合， 對金黃色葡萄球菌、傷寒沙口氏菌、肺炎雙球菌、綠脈桿菌等均有較強的抑菌作用；而較質 能使創(chuàng)面的微血管收縮，具有局部止血作用。臨床上常用于治療細菌感染引起的炎癥，急性 傳染性肝炎，消化道出血等疾病。
[0003] 裸花紫珠顆粒是江西普正藥業(yè)有限公司研發(fā)的中藥制劑，臨床應用中在抗炎止血 方面取得非常好的療效，并已經列入了國家藥品部頒標準。其制備方法為取裸花紫珠干浸 膏，加薦糖粉適量，混勻，用60 %乙醇制成顆粒，干燥，制成。
[0004] 腸病毒是一群病毒的總稱，包括小兒麻搏病毒、柯薩奇A病毒、柯薩奇B病毒、伊科 病毒、腸病毒。由于運些病毒都棲息于人體消化道，在生化特性、流行病學及致病原因上也 具有共同點而被歸納在一起。現在，小兒麻搏病毒已有疫苗可W預防，因此，現在的孩子不 受到小兒麻搏病毒的威脅。流行在孩子中間的病剩下柯薩奇病毒、伊科病毒、腸病毒等。
[0005] 腸病毒引發(fā)的疾病十分廣泛，不同型的病毒可能會有相同癥狀。典型的癥狀包括 瘤疹性咽峽炎、手足日病、無菌性腦膜炎。而屯、肌炎、屯、包膜炎、病毒性腦膜炎、肢體麻搏癥 候群是屬于較嚴重的疾病。并不是所有受到腸病毒感染的人都會有癥狀，因免疫力不同，約 50%~80%是無癥狀感染，有部分的人會有輕微類似感冒或腸胃炎癥狀。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的是裸花紫珠顆粒在制備抗腸病毒方面藥物的應用。所述腸病毒 選自（包括但不限于）:小兒麻搏病毒、柯薩奇A病毒、柯薩奇B病毒、伊科病毒等;優(yōu)選為柯薩 奇B病毒。
[0007] 在本發(fā)明中，所述裸花紫珠顆?？蒞通過商業(yè)渠道獲得，也可W自行制備。其制備 方法為： 1) 取裸花紫珠，加水煎煮兩次，每次加10倍量水，第一次2小時，第2次1小時，合并煎液， 濾過，濾液濃縮至相對密度1.30~1.35(80°C)的稠膏，干燥成干浸膏， 2) 取裸花紫珠干浸膏，加薦糖粉適量，混勻，用60%乙醇制成顆粒，干燥，制成。
[0008] 在本發(fā)明中，所述的抗腸病毒方面，其不僅是指裸花紫珠顆粒可W治療受腸病毒 感染的個體，并且裸花紫珠顆粒也可W預防和減輕腸病毒對機體的感染;尤其是降低機體 對腸病毒的易感性。
[0009] 本發(fā)明通過研究發(fā)現，裸花紫珠顆粒在體外實驗中具有明顯的抗病毒作用，并且 在體內實驗中裸花紫珠顆?？蒞降低小鼠對病毒的感染、縮短小鼠的發(fā)病時間并且極大的 提高了小鼠生存率。
【具體實施方式】
[0010] 下面將進一步的詳細說明本發(fā)明。需要指出的是，W下說明僅僅是對本發(fā)明要求 保護的技術方案的舉例說明，并非對運些技術方案的任何限制。本發(fā)明的保護范圍W所附 權利要求書記載的內容為準。
[0011] 在本發(fā)明實施例中，所使用的裸花紫珠顆粒均購自江西普正藥業(yè)有限公司，每袋 重量3g，含裸花紫珠提取物0. Sg. 實施例1裸花紫珠顆粒體外抗病毒實驗 Hep-2細胞株凍存管從液氮罐取出，立即投入37°C~42°C溫水中融化(遵循慢凍速溶原 則），超凈工作臺內將凍存管中液體移入離屯、管中，100化/min, 5min，棄凍存液，加入8ml濃 度10%的1640細胞培養(yǎng)液輕輕將下層沉淀細胞吹打混勻，用移液管轉移到培養(yǎng)瓶內，在37 °C、5%C02恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長成單層后進行傳代。
[0012] 將COXBi病毒接種于己經長成單層的化P-2細胞上，加1640維持液8ml置37°C、5% 0)2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并設細胞對照，逐日觀察。待細胞出現80%W上的病變時，反復凍融3 次，用吸管輕輕吹打，100化/min，5min，取上清液定量分裝于小青瓶中，膠布封口，放于一80 °0冰箱凍存?zhèn)溆谩?br>[0013] 病毒毒力的測定：將病毒用1640維持液做10倍比系列稀釋不同濃度，縱向重復4 孔，依次接種于己長成單層的化P-2細胞的96孔板中，同時設細胞對照。37°C、5%0)2病毒培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下逐日觀察，連續(xù)觀察5d，將板孔內液體吸棄，加1%中性紅山50山， 37°C、5%0)2培養(yǎng)箱中1小時，棄染液，用洗液將多余染料充分洗漆，加脫色液iil 10化1，室溫 脫色IOmin，用酶標儀在540mn波長測定OD值。根據Reed -Muench公式計算病毒液的半數感 染濃度TCIDso。
[0014] 細胞存活率=各組OD值/正常細胞OD值X 100% 細胞病變率=1-細胞存活率 細胞比距=(高于50%病變率一50%) / (高于50%病變率一低于50%病變率）X 100% TCIDso=Antilog (log高于50%C陽百分率病毒稀釋度+比距X稀釋因子對數） 結果表明：RSV病毒TCIDso為l(r3'si ;因此將病毒原液稀釋1000倍用于實驗。
[0015] 藥物對細胞毒性測定:將待測藥物用1640維持液按二倍比稀釋7個濃度梯度，依次 接種于己經長成單層的化P-2細胞的96孔板中，并設4個復孔及細胞對照孔;37°C、5%C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變，連續(xù)觀察3d，計算藥物的最大無毒濃度。細胞出現 病變者判為藥物毒性，中性紅染色，用酶標儀在540nm波長測定OD值，應用Reed-Muench公式 計算藥物半數中毒濃度(TCso),并確定最小無毒濃度(TCo)。
[0016] TC日日=[Antilog (log高于50%C陽百分率病毒稀釋度+比距）]XC 抗病毒實驗:待測藥物從無毒濃度起用RPMI1640二倍比系列稀釋7個濃度，每孔50W接 種于已長成單層化P-2細胞的96板孔中，每孔再加入50山COXBl病毒液，同時設利己韋林陽 性對照組、板藍根顆粒對照組、病毒對照組及空白細胞對照組，每組4個復孔;病毒對照組和 空白細胞組加入等量的空白培養(yǎng)基。5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細胞病變，待病毒對照出現 90%W上的病變時，1%中性紅染色，并用酶標儀在540nm波長測定OD值。應用Reed-Muench方 法計算藥物半數有效濃度化巧0)和治療指數(TI)。
[0017] EC50=[Antilog (log高于50%CPE百分率病毒稀釋度的值-比距）]XC TI=半數毒性濃度(T巧0) /半數有效濃度巧巧0) 具體結果如下： 病毒感染24小時后病毒組開始出現病變，藥物組也開始顯現病變，細胞在無毒濃度范 圍內隨著藥物濃度的降低，COXBi感染細胞表現明顯，脫落或細胞間融合，變圓、腫脹、破 碎，48小時病毒對照組90%病變，藥物組幾個濃度梯度孔被完全保護;各組藥物的治療指數 如下：
還需要指出的是，本實施例對裸花紫珠顆粒的抑制柯薩奇病毒B2、3和5的活性作用進 行了研究，結果表明裸花紫珠顆粒對C0XB2、3和5的TI值均大于32。
[001引實施例2 取BALB/C小鼠，隨機分組，分為正常對照組、模型組和給藥組，W4倍TCIDsq病毒量 (COXBl)對大鼠進行腹腔注射，正常組給予等量生理鹽水，1小時后立即灌胃給藥裸花紫珠 顆粒或板藍根顆粒lOOmg/kg，模型組和正常組給予等量生理鹽水;連續(xù)給藥14天，14天后處 死存活小鼠，眼眶取血測定LDH、S0D和MDA。
[0019]具體結果如下； 裸花紫珠顆粒對COXBl病毒感染小鼠存活率的影響
血清學指標：
實施例3 于醫(yī)院口診收集柯薩奇B病毒陽性屯、肌炎患者90例，ELISA檢測柯薩奇B病毒陽性，其中 男性47例，女性43例，平均年齡32歲左右，屯、功能II級76例，屯、功能III級14例；隨機分為治 療組和對照組，治療組給予裸花紫珠顆粒，每次1袋(每袋含裸花紫珠提取物0 . Sg);每日3 次，對照組給予病毒挫口服，0.1 g/次，每日4次，兩組病例若出現屯、律失常情況給予抗屯、律 失常藥物予W治療，主要有普羅帕酬，異搏定等，30天為一個療程并觀察患者癥狀改善情 況。
[0020] 療效標準： 顯效:癥狀與體征完全消失，屯、電圖恢復正常，屯、肌酶譜正常。
[0021 ]有效:癥狀與體征改善，屯、電圖及屯、肌酶譜好轉。
[0022] 無效:癥狀與體征無明顯改善。
[0023] 具體結果如下；
本
【發(fā)明內容】
僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技術方 案中所記載的技術特征可W與任意的一個或多個技術方案相組合，運些經組合而得到的技 術方案也在本申請保護范圍內，就像運些經組合而得到的技術方案已經在本發(fā)明公開內容 中具體記載一樣。
【主權項】
1. 裸花紫珠顆粒在制備抗腸病毒方面藥物的應用。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述腸病毒選自（包括但不限于）：小兒麻 痹病毒、柯薩奇A病毒、柯薩奇B病毒、伊科病毒等。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述腸病毒選自柯薩奇B病毒。4. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，裸花紫珠顆?？梢灾委熓苣c病毒感染的個 體，并且裸花紫珠顆粒也可以預防和減輕腸病毒對機體的感染;尤其是降低機體對腸病毒 的易感性。
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，具體涉及裸花紫珠顆粒在制備抗腸病毒方面藥物的應用。所述腸病毒選自（包括但不限于）：小兒麻痹病毒、柯薩奇A病毒、柯薩奇B病毒、伊科病毒等；優(yōu)選為柯薩奇B病毒。
【IPC分類】A61P31/14, A61K9/16, A61K36/85
【公開號】CN105535273
【申請?zhí)枴緾N201510982685
【發(fā)明人】田景振, 侯林, 崔清華, 肖軍平, 吳永忠, 楊偉慶, 康興東, 梁佳, 周朝忠
【申請人】普正藥業(yè)股份有限公司
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月24日