大麻素的生物合成的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本申請(qǐng)案要求2013年2月28日申請(qǐng)的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)案第61/770,766號(hào)的優(yōu)先 權(quán)，所述臨時(shí)專利申請(qǐng)案的內(nèi)容通過引用并入本文中。
[0002] 本發(fā)明涉及大麻素的生物合成。更具體來說，本發(fā)明涉及使用蛋白激酶合成酶酶 類離體制造毫克到克或千克量的適于醫(yī)藥和保健食品應(yīng)用的大麻素的方法，所述酶類負(fù)責(zé) 在植物中合成大麻素。
【背景技術(shù)】
[0003] 大麻素為衍生自大麻(Cannabis sativa)的化合物，大麻為大麻科的一年生植物。 所述植物含有約60種大麻素。大部分熟知的天然存在的大麻素為四氫大麻酚(THC)，其用于 治療各種醫(yī)學(xué)病況，包括青光眼、AIDS消瘦、神經(jīng)痛、治療與多發(fā)性硬化癥有關(guān)的痙攣、肌肉 纖維疼痛以及化學(xué)療法誘發(fā)的惡心。另外，已報(bào)告THC呈現(xiàn)治療過敏、發(fā)炎、感染、癲癇癥、抑 郁癥、偏頭痛、躁郁癥、焦慮癥以及藥物依賴性和戒斷綜合癥的治療效果。THC作為抗催吐藥 物尤其有效并且投予以控制嘔吐，嘔吐是使用類鴉片鎮(zhèn)痛劑和麻醉劑、高度活性抗反轉(zhuǎn)錄 病毒療法和癌癥化學(xué)療法所伴隨的常見副作用。
[0004] 大麻素逐漸用于醫(yī)藥和保健食品應(yīng)用。用于此類應(yīng)用的大麻素化合物幾乎完全獲 自天然來源，例如植物組織。因此，現(xiàn)有技術(shù)披露使用不同溶劑萃取方法從大麻植物的毛狀 體獲得大麻素化合物。一些與此類方法有關(guān)的缺點(diǎn)包括產(chǎn)量差，與植物生長和維持有關(guān)的 尚成本以及與植物提取物的提取和純化有關(guān)的成本。植物的安全性還是制造醫(yī)藥級(jí)大麻素 化合物的成本附加的重要考慮因素。
[0005] 然而，尤其用于治療與化學(xué)療法、疼痛有關(guān)的惡心和嘔吐的大麻素化合物作為刺 激患有消瘦綜合癥的AIDS患者食欲的藥劑以及用于治療青光眼的藥劑的逐漸增加的重要 性已促使本發(fā)明者開發(fā)離體酶催化的半合成方案來大規(guī)模制造大麻素和大麻素類似物。本 發(fā)明方法還允許以降低的成本合成大麻素和其類似物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 前述總體描述以及下文的【附圖說明】和【具體實(shí)施方式】都是示范性以及說明性的，并 且打算提供對(duì)所主張的本發(fā)明的進(jìn)一步解釋。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員從本發(fā)明的以下詳細(xì)描 述容易顯而易知其它目標(biāo)、優(yōu)勢(shì)和新穎特征。
[0007] -方面，本發(fā)明提供一種制造大麻素或大麻素類似物的方法，所述方法通過：
[0008] (a)選擇根據(jù)式I的化合物；
[0010] (b)選擇大麻素合成酶作為將式I化合物轉(zhuǎn)換成大麻素或大麻素類似物的催化劑；
[0011] (C)使式I化合物與大麻素合成酶接觸；以及
[0012] (d)分離來自步驟(b)的產(chǎn)物?？梢砸罁?jù)這一合成策略將分離的產(chǎn)物脫羧。
[0013] 在式I中，R選自-OH、鹵素、-SH或-NRaRb基團(tuán)。取代基RjPR2各自獨(dú)立地選自由以下 組成的群組:-H、-C(0)Ra、-0Ra、任選經(jīng)取代的&-&〇直鏈或分支鏈亞烷基、任選經(jīng)取代的C 2-C10直鏈或分支鏈亞烯基、任選經(jīng)取代的C2-Ciq直鏈或分支鏈亞炔基、任選經(jīng)取代的C 3-C10芳 基、任選經(jīng)取代的C3-Ciq環(huán)烷基、（C 3-Ciq)芳基-(C1-Ciq)亞烷基、（C3-C iq)芳基-(C2-Ciq)亞烯 基以及(C3-C iq )芳基-(C1-Ciq )亞炔基。
[0014] 對(duì)于某些式I化合物,RjPR2連同其鍵結(jié)的碳原子一起形成(：5-&()環(huán)狀環(huán)。一方面， C5-Ciq環(huán)狀環(huán)包含一或多個(gè)選自氧、硫或氮的雜原子。式I中的R3選自由以下組成的群組： H、-C(O) Ra以及C1-Ciq直鏈或分支鏈烷基，而IM5PR b各自獨(dú)立地是-H ^om-NH2JC1-C10) 直鏈或分支鏈烷基或C3-Ciq環(huán)烷基。然而，本發(fā)明方法不允許四氫大麻酚或大麻二酚的合 成。
[0015] 依據(jù)這一策略，大麻素合成酶選自大麻二醇酸合成酶、四氫大麻酚酸合成酶或大 麻環(huán)萜酚酸合成酶群組。
其中X選自-OH、-SH或-NRaRb。
[0017] -方面，本發(fā)明方法描述大麻素合成酶與固體支撐物的固定。根據(jù)上文所述的方 法制造的大麻素和大麻素類似物以單個(gè)對(duì)映異構(gòu)體形式存在。這些化合物的對(duì)映異構(gòu)純度 為至少95 %到至少99 %。
[0018] 根據(jù)另一實(shí)施例提供制造根據(jù)式II的大麻素或大麻素類似物的方法，所述方法通 過：
[0019] (a)使根據(jù)式III的化合物與根據(jù)式IV的化合物；
[0021]在催化式III化合物與式IV化合物反應(yīng)的酶存在下反應(yīng)形成式II化合物；
[0023] (b)使式II化合物與大麻素合成酶接觸；
[0024] (C)分離來自步驟(b)的產(chǎn)物；以及
[0025] (d)任選地使來自（c)的產(chǎn)物脫羧獲得大麻素或大麻素類似物。
[0026] 取代基R、Ri、R2以及R3如上文所定義并且抱選自由以下組成的群組:直鏈或分支鏈 (C1-Ciq )亞烷基、直鏈或分支鏈(C2-Ciq )亞烯基、直鏈或分支鏈(C2-Ciq )亞炔基、-C (0) - (C1-C10)亞烷基、-C(O)-(C2-C1Q)亞烯基以及-C(O)-(C 2-C1Q)亞炔基。此外，對(duì)于式II、111和IV化 合物，任何亞烷基、亞烯基、亞炔基、芳基、芳基亞烷基或環(huán)烷基經(jīng)一或多個(gè)選自由以下組成 的群組的基團(tuán)進(jìn)一步取代：-〇H、鹵素、-NRbRc^-CXC^Rh-CXC^NRUCi-CioH^S^CNjCi-C 4)烷氧基、（C1-C4)鹵烷基以及(C1-C4)羥基烷基，并且R a、Rb以及Rc可各自獨(dú)立地為-m-SH、-NH2、（ C1-Ciq )直鏈或分支鏈烷基或C3-Ciq環(huán)烷基。
[0027]還提供一種用于制造四氫大麻酚、大麻色素或四氫大麻酚和大麻色素兩者或其類 似物的方法，所述方法通過：
[0028] (a)選擇根據(jù)式V的化合物；
[0030] (b)使式V化合物與四氫大麻酚酸合成酶接觸；
[0031] (C)改性包含式V化合物和四氫大麻酚酸合成酶的反應(yīng)混合物的至少一種特性獲 得四氫大麻酚、大麻環(huán)萜酚或四氫大麻酚和大麻色素兩者或其類似物作為產(chǎn)物。
[0032] 對(duì)于式V化合物，R選自-OH、鹵素、-SH或-NRaRb基團(tuán)，RjPR 2各自獨(dú)立地選自由以下 組成的群組:-H、-C(0)Ra、-0Ra、任選經(jīng)取代的&-&〇直鏈或分支鏈亞烷基、任選經(jīng)取代的C 2-C10直鏈或分支鏈亞烯基、任選經(jīng)取代的C2-Ciq直鏈或分支鏈亞炔基、任選經(jīng)取代的C 3-C10芳 基、任選經(jīng)取代的C3-Ciq環(huán)烷基、（C3-Ciq)芳基-(C 1-Ciq)亞烷基、（C3-Ciq)芳基-(C2-C iq)亞烯 基以及(C3-Ciq)芳基-(C1-C iq)亞炔基，并且R3選自K(O)R^C1-Ciq直鏈或分支鏈烷基。對(duì) 于特定化合物，RdPR 2連同其鍵結(jié)的碳原子一起形成C5-Ciq環(huán)狀環(huán)并且取代基RjPRb各自獨(dú) 立地是-H、-OH、-SH、-NH 2、（ C1-C1Q)直鏈或分支鏈烷基或C3-C1Q環(huán)烷基。
[0033] 一方面，改性反應(yīng)混合物的至少一種特性包含改變反應(yīng)混合物的pH，例如將pH改 為約4.0到約8.0單位的范圍內(nèi)從而控制上述方法制造的四氫大麻酚比大麻色素的比率。
[0034] 本發(fā)明技術(shù)還提供用于制造大麻素或大麻素類似物的系統(tǒng)。此類系統(tǒng)包含固持培 養(yǎng)基和多個(gè)細(xì)胞的發(fā)酵器，其中細(xì)胞被配置成產(chǎn)生和分泌大麻素合成酶;含有反應(yīng)物的生 物反應(yīng)器，反應(yīng)物被配置成與大麻素合成酶相互作用形成第一大麻素和第二大麻素，以及 被配置成控制生物反應(yīng)器的條件的控制機(jī)構(gòu)。后一控制機(jī)構(gòu)用于相對(duì)于第二大麻素形成的 量影響第一大麻素形成的量。
[0035] 所述系統(tǒng)可另外包含被配置成至少部分分離所述多個(gè)細(xì)胞與所述培養(yǎng)基的過濾 器，使得分離后含有大麻素的培養(yǎng)基引入到生物反應(yīng)器中。在一個(gè)實(shí)施例中，多個(gè)細(xì)胞表現(xiàn) 的酶包括允許酶結(jié)合到生物反應(yīng)器內(nèi)的鎳支撐物的標(biāo)簽。任何式I化合物或大麻砲酸酸都 可以用作酶四氫大麻酚酸合成酶的底物。視生物反應(yīng)器內(nèi)的條件而定，四氫大麻酚酸或大 麻環(huán)萜酚酸以第一大麻素的形式產(chǎn)生并且第二大麻素將為四氫大麻酚酸和大麻環(huán)萜酚酸 中的另一個(gè)。
【附圖說明】
[0036]圖1為用于根據(jù)示范性實(shí)施例制造大麻素或大麻素類似物的系統(tǒng)的示意性說明。
【具體實(shí)施方式】 [0037] 定義
[0038]如本文所用，除非另外規(guī)定，否則單數(shù)形式"一"和"所述"包括多個(gè)參考物。因此， 舉例來說，提及"一個(gè)/種細(xì)胞"包括多個(gè)/種細(xì)胞，并且提及"一個(gè)/種分子"就是提及一或多 個(gè)/種分子。
[0039]如本文中所用，"約"將為所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解并且在一定程度上將取決于 其使用的情況而變化。如果使用所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員不清楚的術(shù)語，那么考慮到其使用 的情況，"約"將意味著達(dá)到特定術(shù)語的正或負(fù)10%。
[0040]術(shù)語"烷基"指的是具有規(guī)定數(shù)目碳原子的直鏈或分支鏈飽和烴。舉例來說，（C1-C10)烷基意味著包括(但不限于）甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊 基、新戊基、己基、異己基以及新己基等。烷基可未經(jīng)取代或任選地經(jīng)一或多個(gè)如下文所述 的取代基取代。
[0041 ]術(shù)語"烯基"指的是具有規(guī)定數(shù)目碳原子和至少一個(gè)雙鍵的直鏈或分支鏈不飽和 烴。（C2-Ciq)烯基的實(shí)例包括(但不限于）乙烯、丙烯、1-丁烯、2-丁烯、異丁烯、仲丁烯、1-戊 稀、2-戊稀、異戊稀、1-己稀、2-己稀、3-己稀、異己稀、1-庚稀、2-庚稀、3-庚稀、異庚稀、1-辛 烯、2-辛烯、3-辛烯、4-辛烯以及異辛烯。烯基可未經(jīng)取代或任選地經(jīng)一或多個(gè)如下文所述 的取代基取代。
[0042]術(shù)語"炔基"指的是具有規(guī)定數(shù)目碳原子和至少一個(gè)三鍵的直鏈或分支鏈不飽和 烴。（C2-Ciq)炔基的實(shí)例包括(但不限于）乙炔、丙炔、1-丁炔、2-丁炔、1-戊炔、2-戊炔、1-己 炔、2-己炔、3-己炔、1-庚炔、2-庚炔、3-庚炔、1-辛炔、2-辛炔、3-辛炔以及4-辛炔。炔基可未 經(jīng)取代或任選地經(jīng)一或多個(gè)如下文所述的取代基取代。
[0043]術(shù)語"烷氧基"指的是具有規(guī)定數(shù)目碳原子的-0-烷基。舉例來說，（C1-C6)烷氧基包 括-〇-甲基、-〇-乙基、-〇-丙基、-〇-異丙基、-〇-丁基、-〇-仲丁基、-〇-叔丁基、-〇-戊基、-〇-異 戊基、-〇-新戊基、-〇-己基、-〇-異己基以及-〇-新己基。
[0044]術(shù)語"芳基"指的是3到14元單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)或多環(huán)芳香族烴環(huán)系統(tǒng)。芳基的實(shí)例 包括萘基、芘基和蒽基。芳基可未經(jīng)取代或任選地經(jīng)一或多個(gè)如下文所述的取代基取代。 [0045]單獨(dú)或作為另一取代基的部分的術(shù)語"亞烷基"、"亞烯基"和"亞芳基"分別意味著 衍生自以下的二價(jià)基團(tuán)：烷基、環(huán)烷基、烯基、芳基或雜芳基，如-CH 2CH2CH2CH2-所示范。對(duì)于 亞烷基、烯基或芳基連接基團(tuán)，未暗示連接基團(tuán)的方向。
[0046] 術(shù)語"鹵素"和"齒基"指的是-F、-C1、-Br或-工。
[0047] 術(shù)語"雜原子"意味著包括氧(0)、氮(N)和硫(S)。
[0048] "羥基"指的是-OH基團(tuán)。
[0049]術(shù)語"羥基烷基"指的是具有規(guī)定數(shù)目碳原子的烷基，其中烷基的氫原子中的一或 多個(gè)置換為-OH基團(tuán)。羥基烷基的實(shí)例包括(但不限于）-〇120!1、-〇12〇120!1、-〇1 2〇12〇120!1、-CH2CH2CH2CH2OI-CH2CH2CH2CH2CH2OKH2CH2CH2CH2CH2CH2OH 以及其分支鏈形式。
[0050] 術(shù)語"環(huán)烷基"指的是單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)或多環(huán)3到14元環(huán)系統(tǒng)，其飽和、不飽和或?yàn)?芳香族的。雜環(huán)可通過任何雜原子或碳原子連接。環(huán)烷基包括如上文所定義的芳基和雜芳 基。環(huán)烷基的代表性實(shí)例包括(但不限于)環(huán)乙基、環(huán)丙基、環(huán)異丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己 基、環(huán)丙烯、環(huán)丁烯、環(huán)戊烯、環(huán)己烯、苯基、萘基、蒽基、苯并呋喃基以及苯并噻吩基。環(huán)烷基 可未經(jīng)取代或任選地經(jīng)一或多個(gè)如下文所述的取代基取代。
[0051] 術(shù)語"腈或氰基"可互換使用并且指的是結(jié)合于雜芳基環(huán)、芳基環(huán)和雜環(huán)烷基環(huán)的 碳原子的-CN基團(tuán)。
[0052] 術(shù)語"胺或氨基"指的是-NRcRd基團(tuán)，其中Rc和Rd各自獨(dú)立地指的是氫、（C1-C 8)烷 基、芳基、雜芳基、雜環(huán)烷基、（C1-C8)鹵烷基以及(C 1-C6)羥基烷基。
[0053] 術(shù)語"烷芳基"指的是心-心烷基，其中C1-C8烷基鏈的至少一個(gè)氫原子置換為芳基 原子，所述原子可任選地經(jīng)一或多個(gè)如下文所述的取代基取代。烷芳基的實(shí)例包括(但不限 于）甲基苯基、乙基萘基、丙基苯基以及丁基苯基。
[0054] "芳基亞烷基"指的是二價(jià)亞烷基，其中C1