一種RNAi技術(shù)聯(lián)合小劑量ALA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞原卟啉IX積聚的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種RNAi技術(shù)聯(lián)合小劑量ALA誘導(dǎo) 腫瘤細(xì)胞原卟啉IX積聚的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥已成為威脅人類健康和生命的一大殺手，而癌癥的發(fā)現(xiàn)往往都已處于中晚 期，約75%的患者就診時腫瘤已到進(jìn)展期，腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移。而早期癌癥病灶的發(fā)現(xiàn)對癌癥 的治療具有至關(guān)重要的意義，但是目前大部分癌癥均缺乏早期癥狀及有效的診斷方法。 [0003]腫瘤選擇性積聚原卟啉IX(PplX)已被證實伴隨于成瘤過程的早期，可發(fā)生在有或 無外源性5-氨基酮戊酸(5-4111；[11016￥111；[11；[03(^(141^)誘導(dǎo)的情況下。研究發(fā)現(xiàn)，亞鐵螯合 酶(FECH)可催化二價鐵嵌入原卟啉IX(PpIX)生成血紅素，而很多類型腫瘤的亞鐵螯合酶 (FECH)活力較正常細(xì)胞為低，所以將PpIX轉(zhuǎn)化為血紅素減少，從而導(dǎo)致腫瘤組織中PpIX增 多，在此基礎(chǔ)上，使用合適波長及能量的光源激發(fā)腫瘤內(nèi)部蓄積的PpIX后，比較不同組織部 位的PpIX熒光含量及分布差異，就可發(fā)現(xiàn)早期微小癌灶。
[0004] 目前，國內(nèi)外一直采用大劑量外源性5-氨基酮戊酸（5-Aminolevulinic acid， ALA)的方式來增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)PpIX的合成量，以便標(biāo)示腫瘤病灶。而因為部分腫瘤的FECH 活性并未明顯降低，故能夠?qū)⑼庠葱訟LA誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)源性PpIX轉(zhuǎn)化為血紅素，從而使 PpIX迅速流失，因此該方式往往只能產(chǎn)生低濃度的腫瘤PpIX，必須使用更大劑量的ALA，才 能產(chǎn)生足夠的PpIX在腫瘤組織積聚。采用大劑量使用5-氨基酮戊酸(ALA)的方式，不僅存在 上述的缺陷，而且大劑量的ALA用量還極易產(chǎn)生嚴(yán)重的全身尤其神經(jīng)毒副作用。
[0005] 發(fā)明人前期研究利用RNAi技術(shù)阻斷FECH基因的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上輔小劑量的外源 性ALA，通過增加合成、減少去路的雙重效能的方式以提高腫瘤細(xì)胞原卟啉IX積聚濃度，從 而改善了單用大劑量外源性ALA的模式難收集較高濃度的PpIX的方法上的不足。但是，在利 用RNAi技術(shù)阻斷FECH表達(dá)的效能方面，目前所使用單段siRNA的方法仍有很大的改進(jìn)空間， 雖然理論上使用單段siRNA可達(dá)到很高的基因敲減率，但是以我們多年的實際操作經(jīng)驗及 實驗結(jié)果分析可知，實際工作中該方法一般只能達(dá)到約60~65%范圍水平的基因敲減率， 因此，在此基礎(chǔ)上輔以小劑量外源性ALA標(biāo)示腫瘤病灶的效果不甚理想，尤其是針對早期病 灶的標(biāo)示。
[0006] 因提高RNAi技術(shù)阻斷FECH表達(dá)的效能是提高腫瘤細(xì)胞PpIX積聚濃度的最關(guān)鍵的 環(huán)節(jié)，因此，探索更有效地提高對腫瘤細(xì)胞FECH基因的敲減率的方法，已成為此技術(shù)領(lǐng)域中 的一項重大挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有RNAi技術(shù)結(jié)合小劑量外源性ALA標(biāo)示腫瘤病 灶技術(shù)的缺陷和不足，提供一種更有效的RNAi技術(shù)聯(lián)合小劑量ALA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞原卟啉IX 積聚的方法，該方法利用RNAi技術(shù)沉默抑制亞鐵螯合酶(FECH)的表達(dá)，從而使得外源性ALA 所誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性PpIX能夠更有效地積聚在腫瘤細(xì)胞，達(dá)到使用小劑量外源性ALA即可 有效標(biāo)示腫瘤病灶的目的，提高腫瘤的檢出率。
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種RNAi技術(shù)聯(lián)合小劑量ALA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞原卟啉IX積聚的 方法。
[0009] 本發(fā)明另一目的是提供上述方法中所使用的RNAi干擾序列及其在腫瘤診斷方面 的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0011] -種RNAi技術(shù)聯(lián)合小劑量ALA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞原卟啉IX積聚的方法，是在外源性添 加小劑量ALA的同時，利用RNAi技術(shù)沉默抑制亞鐵螯合酶FECH的表達(dá)，從而使得外源性ALA 所誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性PpIX能夠更有效地積聚在腫瘤細(xì)胞;其中，所述利用RNAi技術(shù)沉默抑 制亞鐵螯合酶FECH表達(dá)所用的雙鏈siRNA的反義鏈的核苷酸序列與靶基因部分或全部互 補，雙鏈siRNA的正義鏈與反義鏈部分或全部互補。
[0012] 進(jìn)一步地，所述沉默抑制亞鐵螯合酶FECH的表達(dá)是利用雙鏈740FECH-siRNA、 1072FECH-siRNA 和 3389FECH-siRNA 中的任一個或三者聯(lián)用；所述 740FECH-siRNA、 1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的反義鏈的核苷酸序列分別與SEQ ID NO. 1所示序列的 740、1072、3389位開始的一段核苷酸序列互補；該段互補的核苷酸序列由18~29個連續(xù)的 核苷酸組成。
[0013]優(yōu)選地，所述該段互補的核苷酸序列由19~25個連續(xù)的核苷酸組成。
[0014]更優(yōu)選地，所述該段互補的核苷酸序列由19~23個連續(xù)的核苷酸組成。
[0015]最優(yōu)選地，所述該段互補的核苷酸序列由19個連續(xù)的核苷酸組成。
[0016]另外，優(yōu)選地，所述雙鏈siRNA片段的兩條鏈的3'端含有二核苷酸，而且這二核苷 酸最好是uu。
[0017] 具體地，作為一種優(yōu)選的實施方案，所述雙鏈740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和 3389FECH-siRNA的核苷酸序列分別如SEQ ID從).2~7所示。即如下所示：
[0018] (1)雙鏈740FECH-siRNA
[0019] 正義鏈740FECH-S1 (如SEQ ID 從).2所示）：
[0020] 5，GCAGCUUAAAUGCCAUUUAUU 3,（第二條鏈）；
[0021] 反義鏈740FECH-AS1 (如SEQ ID 從).3所示）：
[0022] 3'UUCGUCGAAUUUACGGUAAAU 5'（第一條鏈，與SEQ ID N0.1 所示序列的740~758位 核苷酸互補）。（SEQ ID NO. 1所示序列的740~758位核苷酸：gcagcttaaatgccattta)。
[0023] (2)雙鏈 1072FECH-siRNA
[0024] 正義鏈 1072FECH-S2(如SEQ ID N0.4所示）：
[0025] 5，GGUCCUCAAACAGACGAAUUU 3,（第二條鏈）；
[0026] 反義鏈 1072FECH-AS2(如SEQ ID 從).5所示）：
[0027] 3'UUCCAGGAGUUUGUCUGCUUA 5'（第一條鏈，與SEQ ID N0.1 所示序列的 1072~1090 位核苷酸互補）。（SEQ ID NO. 1所不序列的1072~1090位核苷酸：ggtcctcaaacagacgaat)。
[0028] (3)雙鏈3389FECH-siRNA
[0029] 正義鏈3389FECH-S3(如SEQ ID 從).6所示）：
[0030] 5，CAGGCAAAGAGGAAUUUAUUU 3,（第二條鏈）；
[0031] 反義鏈3389FECH-AS4(如SEQ ID N0.7所示）：
[0032] 3，UUGUCCGUUUCUCCUUAAAUA 5,（第一條鏈，與與SEQ ID N0.1 所示序列的3389~ 340 7位核苷酸互補^(SEQ ID NO. 1所示序列的3 389~340 7位核苷酸： caggcaaagaggaatttat)〇
[0033] 另外，進(jìn)一步地，上述的添加小劑量ALA是指本發(fā)明所述之體外細(xì)胞實驗中低于或 等于O.lmM的ALA濃度，或本發(fā)明所述之動物實驗中低于或等于1毫克/公斤體重的ALA濃度。 [0034]另外，根據(jù)所述的內(nèi)容，一種干擾抑制亞鐵螯合酶FECH表達(dá)的雙鏈siRNA也在本發(fā) 明的保護范圍之內(nèi)，所述雙鏈siRNA為雙鏈740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA中的任一個或三者的組合；所述雙鏈740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-81尺熟的核苷酸序列分別如3￡〇10從).2~7所示。
[0035] 而且，上述雙鏈siRNA在制備腫瘤診斷試劑方面的應(yīng)用也應(yīng)在本發(fā)明的保護范圍 之內(nèi)。這種核酸分子可以單獨使用或與其它物質(zhì)結(jié)合使用時可作為藥物和/或診斷試劑。例 如，這項發(fā)明的核酸分子可能包含給藥的運輸載體，包括脂質(zhì)體，載體和稀釋劑及它們的鹽 和/或這種載體是藥學(xué)中被接受的某種劑型。
[0036] 上述雙鏈siRNA還可用于制備藥物組合物，這個組合含有一個或多個本發(fā)明的核 酸分子，即所述的雙鏈siRNA，核酸分子位于一個可接受的載體中，如穩(wěn)定劑，緩沖劑等類似 物質(zhì)。
[0037] 上述的藥物組合物也可以制造成口服的片劑，膠囊或酏劑，直腸給藥的栓劑，可注 射給藥的無菌溶液，懸浮液，和其它已知的復(fù)合體。
[0038]另外，上述運輸載體，即運輸該核酸分子(雙鏈siRNA)的載體最好是表達(dá)載體，并 且最好能提供特異性的或靶向的運輸方式。
[0039]本發(fā)明具有以下有益效果：
[0040]本發(fā)明提供了一種有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞原卟啉IX積聚的方法，并且只需使用小劑量 的外源性ALA，具體方法是在外源性添加小劑量ALA的同時，利用RNAi技術(shù)沉默抑制亞鐵螯 合酶FECH的表達(dá)，從而使得大量的PpIX積聚在腫瘤細(xì)胞。
[0041 ] 同時，本發(fā)明提供了上述RNA i所用的雙鏈s i RNA片段，即740FECH-s i RNA、 1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA，對FECH具有很高的沉默效率，利用其沉默處理的同時， 添加小劑量外源性ALA，即可快速、有效地使得PpIX大量積聚在腫瘤細(xì)胞，可實現(xiàn)腫瘤病灶 的標(biāo)示，尤其是對于早期腫瘤的標(biāo)示，具有顯著的意義。
【附圖說明】
[0042]圖1為熒光定量PCR檢測FECH基因表達(dá)水平的結(jié)果。
[0043] 圖2為Western blot轉(zhuǎn)膜時的疊放順序。
[0044] 圖3為Western blot結(jié)果。
[0045] 圖4為熒光定量光譜儀檢測轉(zhuǎn)染siRNA和/或加ALA處理后的MDA-MB-435細(xì)胞內(nèi)的 PpIX濃度。
[0046] 圖5為顯微熒光定量檢測0.1 mM ALA處理后MDA-MB-435細(xì)胞內(nèi)的PpIX的積聚情況。
[0047] 圖6為顯微熒光定量檢測50nM 3389-FECH-siRNA處理后MDA-MB-435細(xì)胞內(nèi)的PpIX 的積聚情況。
[0048] 圖7為顯微熒光定量檢測50nM 3389-FECH-siRNA處理MDA-MB-435細(xì)胞后，再加上 0.1 mM劑量的ALA細(xì)胞內(nèi)的PpIX的積聚情況。
[0049] 圖8為顯微熒光定量檢測50nM 3389-FECH-siRNA處理MDA-MB-435細(xì)胞后，再加上 ImM劑量的ALA，細(xì)胞內(nèi)的PpIX的積聚情況。
[0050] 圖9為激光共聚焦顯微鏡檢查腫瘤細(xì)胞內(nèi)積聚的PpIX熒光。
[00511圖10為動物實