非糖基化溶葡球菌素變體蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本申請要求2013年8月6日提交的美國臨時專利申請系列號61/862,599的優(yōu)先權(quán)， 所述臨時申請的內(nèi)容整體通過參考以其全文并入本文。
[0002] 本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)授予的資助 號為1R21 AI098122的政府支持下做出的。美國政府在本發(fā)明中具有一定權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0003] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是一種重要的細菌病原體，其引起多 種可能危及生命的感染，包括皮膚病損（Pantosti，A ?和 M.Venditti .2009.Eu;r.Respi;r.J.34: 1190-1196)、肺部感染（Defres 等， 2009.Eur.Respir.J.34: 1470-1476)、菌血癥（Wisplinghoff 等， 2004 ? Clin ? Infect ? Dis ? 39:309-317)和心內(nèi)膜炎（Fowler等，2005 ? JAMA 293:3012-3021) 〇 盡管醫(yī)學共同體努力嘗試更有效地對抗這種病原體，但在最近幾十年中醫(yī)院和社區(qū)獲得性 金黃色葡萄球菌（S.aureus)感染的病例仍不斷增加（Hospital Infections Program. 1999 .Am. J. Infect .Control 27:520-532)，并且臨床分離株中抗生素耐藥性的發(fā) 生率也穩(wěn)步增長（Taubes，G. 2008Science 321: 356-361)。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) (MRSA)的出現(xiàn)和快速傳播深深地困擾著公共衛(wèi)生官員和健康護 理提供者，這類耐甲氧西林金黃色葡萄球菌目前占醫(yī)院和某些社區(qū)背景中金黃色葡萄球菌 (S.aureus)分離株的50% 以上（Grundmann等，2006 .Lancet 368:874-885)。此外，已知MRSA 獲得另外的耐藥性元件，由此產(chǎn)生危險的多藥耐藥菌株。特別引人擔憂的是對被廣泛當作 MRSA感染的"終極治療藥物"（drug of last resort)的萬古霉素表現(xiàn)出降低的敏感性的 MRSA分離株(Taubes，G.2008Science 321:356-361)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)強調(diào)了對開發(fā)通 過與常規(guī)抗細菌化學療法不同的機理起作用的新的抗葡萄球菌藥劑的迫切需求（Lowy， F?D?2007?Nat?Med?13:1418-1420)。
[0004] 溶葡球菌素(LST)是一種鋅依賴性的甘氨酰甘氨酸內(nèi)肽酶，其最初被編碼在金黃 色葡萄球菌(S.aureus)的一種環(huán)境競爭者--模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans) 的pACKl質(zhì)粒上(Gargis等，2010.Plasmid 64:104-109) 1ST酶選擇性并高效地降解金黃色 葡萄球菌（S.aureus)細胞壁的肽聚糖組分中的五甘氨酸交聯(lián)物，最終引起細菌裂解和死 亡。LST 發(fā)現(xiàn)于 1960 年代（Schindler，C.A ?和 V.T? Schuhardt ? 1964 .Proc ? Natl .Acad? Sci ? USA 51:104-109)，并且從那時起已經(jīng)歷了不 同研究組和組織的各種不同程度的臨床前開發(fā)和甚至小規(guī)模的臨床試驗(Harrison等， 1975.Infect.Immun.11:309-312;Zygmunt，W.A?和P?A?Tavormina?1972?Prog?Drug Res ? 16: 309-333;Walsh等，2003 .Antimicrob .Agents Chemother ? 47: 554-558; Stark等， 1974.New Engl.J.Med.291:239-240;Martin，R.R?和A.White.1968.J.Lab.Clin.Med.71: 791-797)。關(guān)于LST作為治療藥劑的早期興趣由于常規(guī)藥物例如甲氧西林的容易獲得而消 失，但由于廣泛傳播的抗生素耐藥性和抗微生物劑開發(fā)管道的變窄，對LST生物醫(yī)學應用的 熱情被重新點燃（Szweda等，2012.Appl .Microbiol .Biotechnol .96:1157-1174) 〇
[0005] LST臨床應用的一個障礙是根除某些感染所需的高劑量。在患有多藥耐藥葡萄球 菌肺炎、多發(fā)性膿腫和蜂窩組織炎的無反應性白血病患者中，LST似乎表現(xiàn)出良好效能 (Walsh等，2003 .Antimicrob ? Agents Chemother ? 47: 554-558)，但是這種效果需要酶的 500mg全身性推注。在另一項研究中，凝固酶陽性金黃色葡萄球菌(S. aureus)的鼻部攜帶者 顯示出在鼻內(nèi)LST治療后，所述病原體被有效清除，但這種效果也需要大量酶(每天三次用 5mg/ml LST溶液進行鼻沖洗，共一周）（Mart in，R ? R ?和A ? Whi te ? 1968 ? J ? Lab ? Cl in ? Med ? 71: 791-797)。在鼻腔帶菌清理的其他人類研究中，在類似的高劑量水平下獲得了類似的結(jié)果 (Quickel等，1971 .Appl .Microbiol ? 22:446-450 ; Harr is等，1967 .Ant imicrob .Agents Chemother.7:110-112)。在與導管相關(guān)的金黃色葡萄球菌（S.aureus)生物膜的鼠類模型 中，在4天的治療方案期間進行全身性LST給藥以清除已建立的生物膜以及單次預防性給 藥，防止了隨后生物膜在留置導管上的形成（Kokai-Kun等， 2009. J.Antimicrob.Chemother. 64:94-100)。然而，將有效劑量外推到人類患者，將需要在 4天內(nèi)給藥超過16克酶。因此，盡管LST在動物模型和甚至人類研究中具有被證實的一致的 效能，但將有效劑量推廣到大范圍臨床應用，將需要特別高效的生產(chǎn)平臺。
[0006] 為達到這個目的，已在廣泛的各種微生物表達宿主中生產(chǎn)LST。例如，溶葡球菌素 基因已在枯草芽孢桿菌（B.subtilis)細胞中表達（Zhdaova等， 2001 .Zh.Mikrobiol .Epidemiol. Tmmunobi 〇1 ? 4:3-6)。商品化LST的一個來源是天然生物體 模擬葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的高細胞密度培養(yǎng)物，但來自于這個系統(tǒng)的工 業(yè)規(guī)模生產(chǎn)得率作為專有信息未被公開?？蛇x地，來自于細菌宿主大腸桿菌(Escherichia coli)的表達得率已知在10至20mg/L的范圍內(nèi)（Sweda等，2001 ? Protein Expr ? Purif ? 22: 467-471 ;Szwe da 等，2005.J.Biotechnol ? 117 : 203-213; Sharma 等，2006.Protein Expr. Purif. 45: 206-215)，并且這種重組平臺也是商業(yè)來源材料的重要貢獻者。已使用乳 酸乳球菌(Lactococcus lactis)NICE系統(tǒng)進行用于臨床試驗的大規(guī)模LST生產(chǎn)(Mierau等， 2005.Microb.Cell Fact.4:15;Mierau等，2005.Microb.Cell Fact.4:16)。在大體積高細 胞密度發(fā)酵中實現(xiàn)了 l〇〇mg/L的表達水平，但是最終的純化得率僅為40mg/L(Mierau等， 2005 .Microb. Cel 1 Fact. 4:15)。隨后對這種系統(tǒng)的過程優(yōu)化將生物反應器表達水平提高 到300mg/L(Mierau等，2005 .Microb ? Cell Fact ? 4:16)，但仍存在相當大的進一步改進空 間。最后，應該注意到，L S T也已在哺乳動物細胞中表達（W i 1 1 i a m s 〇 n等， 1994. Appl.Environ.Microbiol. 60:771-776)，但沒有嘗試對得率進行最大化或甚至定量。
[0007] 幾項專利和專利申請描述了在各種微生物表達系統(tǒng)中生產(chǎn)LST。例如，美國專利 如.4,931，390和￡?0299978公開了在大腸桿菌(￡.(：〇11)、枯草芽孢桿菌(8.8111^1118)和球 形芽孢桿菌（B.sphaericus)中表達克隆的LST基因。美國專利申請No. 2002/040924和W0 2003/082184公開了在大腸桿菌（E.coli)、乳酸乳球菌（L.lactis)和球形芽孢桿菌 (B.sphaericus)細胞中生產(chǎn)均質(zhì)形式的重組LST蛋白。美國專利No.6,897,041、W0 2001/ 029201、EP1224271和KR1020020064886都公開了在大腸桿菌(E. coli)中表達重組LST的方 法。美國專利申請No. 2002/0006406公開了可以攜帶單一突變并且可以重組表達的LST的類 似物和變體。所述變體在球形芽孢桿菌(B.sphaericus)中生產(chǎn)，并且所述變體在野生型LST 的218位置處具有單一突變。美國專利申請No. 2005/0118159公開了具有增強的溶葡萄球菌 活性的截短的LST分子。所述生產(chǎn)在大腸桿菌(E.coli)、乳酸乳球菌(L.lactis)或球形芽孢 桿菌(B. sphaericus)中進行。美國專利申請No. 2008/0095756公開了LST變體和使用方法。 所述變體被描述為是"去免疫化"分子，意味著已從所述LST序列中去除T-細胞表位和結(jié)構(gòu) 域。美國專利申請No. 2009/0186380公開了在大腸桿菌中表達LST的方法以及一系列突變體 LST 分子。最后，美國專利 No. 8，241，901、美國申請 No. 2007/009351 和 KR102008018960 公開 了在大腸桿菌中以高水平表達LST的方法。在這些專利和專利申請中公開的方法均未涉及 酵母中的LST表達。
[0008] LST代表了用于治療葡萄球菌感染、尤其是MRSA菌株的感染的有希望的治療藥劑。 然而，正如上面討論的，用于所述酶的常規(guī)表達系統(tǒng)受到各種限制，并且對于高效且成本效 益高的生產(chǎn)方法仍存在需求，以便于臨床推廣和非醫(yī)學應用的開發(fā)。
[0009]巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是近年中已被證明是高度成功的異源表達宿 主的酵母生物體(Cregg等，2