甲基阿魏酸在制備預(yù)防和治療酒精性肝病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是甲基阿魏酸在制備預(yù)防和治療酒精性肝病 藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 酒精性肝病(alcoholic liver disease ALD)是由于長期大量飲酒所導(dǎo)致的肝臟 疾病，初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，如果損傷持續(xù)存在，進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化和 肝硬化，嚴(yán)重酗酒時可誘發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死甚至肝功能衰竭。酒精濫用和酒精依賴己成為 當(dāng)今世界上日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，在我國酒精性肝病是僅次于病毒性肝炎的第二大肝 臟疾病。隨著我國居民生活方式、膳食結(jié)構(gòu)的改善和酒類產(chǎn)量及變種的增加，我國酒精性肝 病在所有肝病中的比例有逐年增加趨勢。因此研究有明確療效的治療酒精性肝損傷的藥物 顯得非常必要。積極開展有效中草藥及其單體藥物防治酒精性肝病的臨床研究，成為肝病 領(lǐng)域面臨的新課題。
[0003] 酒的主要成份乙醇，經(jīng)胃腸消化器官后約有90%在肝臟中被代謝。乙醇代謝過程 會產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，R0S) AOS包括超氧陰離子(〇2_)、過氧化 氫(H202)、羥自由基(0H-)，過量的R0S使得機(jī)體抗氧化因子耗竭，打破體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的 平衡，表現(xiàn)在肝臟超氧化物歧化酶（S0D)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶 (CAT)等酶的活力下降，丙二醛(MDA)含量增加，肝臟損傷，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常，肝臟炎癥反 應(yīng)，肝臟纖維化，是ALD發(fā)病的重要機(jī)制。
[0004] 甲基阿魏酸是從蟬翼藤莖皮提取得到的有機(jī)酸類化合物，化學(xué)名為3，4_二甲氧 基-苯丙烯酸，分子結(jié)構(gòu)式如下：
[0005]
[0006] 現(xiàn)有報道表明，甲基阿魏酸具有較強(qiáng)的抗病毒、免疫增強(qiáng)和抗纖維化等多種活性。 甲基阿魏酸抗肝纖維化的作用體現(xiàn)在可以抑制肝星狀細(xì)胞HSC-T6的增殖與膠原分泌;可以 影響四氯化碳(CCL 4)及D-氨基半乳糖造成的急性肝損傷小鼠模型血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、 谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性及肝組織MDA、SOD和GSH-Px的含量;可以影響CCL 4造成的慢性肝纖 維化大鼠模型的血清AST、ALT、膽紅素(BIL)、血清中層粘蛋白（LN)、透明質(zhì)酸(ΗΑ)、ΙΠ 型前 膠原(PC-m)、IV膠原(IV-C)和肝組織中羥脯氨酸(HyP)含量，來實現(xiàn)抗纖維化的作用。
[0007] 甲基阿魏酸對乙醇誘導(dǎo)的酒精性肝病的預(yù)防與治療作用卻未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供甲基阿魏酸的新用途，即在制藥中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種甲基阿魏酸的新用途，它是用于治療酒精性肝病，即是 將從蟬翼藤中提取出的甲基阿魏酸制成片劑、膠囊、顆?；蜃⑸鋭┑葎┬鸵灾委熅凭愿?病，其劑量為l-l〇〇mg/kg甲基阿魏酸/日，可分成2-3次服用。
[0010]本發(fā)明所述甲基阿魏酸是從蟬翼藤莖皮提取得到的有機(jī)酸類化合物，其提取工藝 為:將蟬翼藤莖皮粉碎，95%乙醇回流提取3次-浸膏用100~200目硅膠拌樣-以氯仿回流 洗脫-洗脫液減壓濃縮-中壓硅膠色譜三氯甲烷:乙醚（1:5)梯度洗脫-收集洗脫液，揮去 溶劑得白色粉末結(jié)晶-再經(jīng)重結(jié)晶和Sephadex LH220凝膠柱色譜純化（甲醇洗脫)-得到 白色針狀結(jié)晶。
[0011] 本發(fā)明通過乙醇誘導(dǎo)L-02細(xì)胞損傷模型證實甲基阿魏酸可以降低MDA水平，并提 高S0D、GSH-Px與CAT的活性。通過動物試驗證明，甲基阿魏酸可以顯著降低急性酒精性肝損 傷大鼠的ALT、AST、MDA含量，顯著提高S0D、GSH-Px和CAT活性；甲基阿魏酸可以明顯降低慢 性酒精性肝損傷大鼠的甘油三酯（TG)、ALT、AST和MDA含量，顯著提高S0D、GSH-Px和CAT活 性。以上細(xì)胞與動物實驗結(jié)果表明：甲基阿魏酸具有確切的預(yù)防和治療酒精性肝病作用，可 單方或復(fù)方用于制備預(yù)防和治療酒精性肝病的藥物。
【具體實施方式】
[0012] 以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述：
[0013] 實施例1甲基阿魏酸對乙醇誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞系(L-02)的影響
[0014] 1.1不同濃度甲基阿魏酸對L-02細(xì)胞存活率的觀察。
[0015] 取對數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板，每孔5000個細(xì)胞，24h后加入一定濃度的甲基阿魏 酸，每個藥物濃度設(shè)5個復(fù)孔，加藥44h后加入MTT( 5mg/ml) 20ul繼續(xù)孵育4h，將培養(yǎng)基倒盡， 吸干，每孔加入二甲亞砜200ul，混勻后置自動酶標(biāo)儀(檢測波長490nm)讀取各孔光密度值 (0D值），記錄結(jié)果，并計算存活率。存活率（％) = (實驗組一空白對照組)/(正常對照組一空 白對照）X 100 %。結(jié)果見表1。
[0016] 表1.甲基阿魏酸對L-02細(xì)胞存活率的影響
[0017]
[0018] 從結(jié)果可知，500 . Oμg/ml以下的甲基阿魏酸細(xì)胞存活率大于90 %，對L-02細(xì)胞沒 有毒性。
[0019] 1.2甲基阿魏酸對5%乙醇誘導(dǎo)L-02細(xì)胞模型的影響
[0020] L-02細(xì)胞接種于96孔板，每孔2萬個細(xì)胞，24小時后棄去培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為10組， 每孔加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基0.2ml和誘導(dǎo)藥物。1為正常組、2為5%乙醇模型組、3-10依次為5 %乙醇模型組+MFA藥物干預(yù)，MFA的濃度依次為0.78125、1.5625、3.125、6.25、 12.5、25、50、lOOyg/萬個細(xì)胞，每個藥物濃度設(shè)5個復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)8h后加 MTT (5mg/ml) 20ul 繼續(xù)孵育4h，測0D值并計算存活率。結(jié)果見表2。
[0021] 表2甲基阿魏酸對5%乙醇誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞存活率的影響
[0022]
[0023] bcl-2 備注：**P<0 · 01，ΛΛΡ<0 · 01，ΛΡ<0 · 05。
[0024] 結(jié)果通過SPSS的單因數(shù)方差分析，模型組與正常組有顯著性差異，Ρ〈0.01，除3、4 藥物干預(yù)組外，其余藥物干預(yù)組與模型組均有差異(ρ〈0.01或？〈〇.〇5)。7、8、9、10組藥物干 預(yù)組對細(xì)胞存活率影響接近，組間差異不顯著？>〇.〇5,5、6、7組間差異顯著0〈〇.〇1或？〈 0.05)，因此選擇3.125、6.25和12.5yg/萬個細(xì)胞濃度的甲基阿魏酸作為干預(yù)細(xì)胞的3個藥 物濃度。
[0025] 1.3甲基阿魏酸對5%乙醇誘導(dǎo)L-02細(xì)胞內(nèi)MDA含量和S0D、GSH-Px、CAT酶活性的測 定
[0026]取對數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板，每孔32萬個細(xì)胞，在5 %⑶2，37 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，棄 去培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為正常對照組，5%乙醇模型組和5%乙醇+藥物低、中、高劑量組。每組 加含10%胎牛血清的DMEA培養(yǎng)基0.32ml，模型組入加乙醇使終濃度為5%，藥物組加終濃度 為5%乙醇和甲基阿魏酸(濃度依次為3.125、6.25和12.5yg/萬個細(xì)胞），各設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng) 箱孵育12h后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融破碎后，按MDA、S0D、GSH-Px和CAT檢測試劑盒方法測定含 量與酶活性，結(jié)果見表3。
[0027] 表3.甲基阿魏酸對乙醇誘導(dǎo)L-02細(xì)胞MDA、S0D、GSH-Px和CAT的影響
[0028]
[0029] 注：與正常對照組比較叩<0.05，bP<0.01;與模型組比較叩<0.05，dP<0.01。
[0030] 由表3可知，與正常對照組相比，乙醇模型組MDA水平顯著上升，S0D和GSH-Px、CAT 的活性明顯下降(P<〇.01)，經(jīng)甲基阿魏酸處理，MDA含量下降，S0D、GSH-Px和C