夫西地酸或其藥用鹽在制備抗手足口病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥新用途領(lǐng)域。更具體地，涉及一系列夫西地酸或其藥用鹽在制備 抗手足口病藥物中的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)是由腸道病毒引起的急性傳染 病，主要在5歲以下兒童中發(fā)病。HFMD主要臨床癥狀為手、足、口腔等部位斑丘疹、皰疹，重癥 患者可出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，甚至死亡。引發(fā)HFMD的腸道病毒有20多種（型），其中以柯 薩奇病毒A16型(CVA16)和腸道病毒71型(EV71)最為常見，其它不同型的腸道病毒和柯薩奇 病毒也可致病。EV71和CVA16具有高度傳染性，感染呈全球性分布，特別是在亞太地區(qū)，所引 起的手足口病已成為一種嚴(yán)重危害社會公眾健康的疾病。由于缺乏特異、高效的抗病毒藥 物，根據(jù)手足口病診療指南(2013年版），目前主要采取隔離和對癥治療。因此，急需抗EV71 和CVA16等腸病毒藥物的研制與開發(fā)。
[0003] 新藥研發(fā)時間長、研發(fā)成本高昂，從現(xiàn)有藥物中篩選抗病毒藥物則是一種快速、經(jīng) 濟(jì)的有效策略。夫西地酸由梭鏈孢酸脂球菌產(chǎn)生，屬于梭鏈孢酸類抗生素，臨床上用其鈉鹽 (夫西地酸鈉)進(jìn)行抗感染治療。夫西地酸是一類窄譜抗生素，主要用于G+菌感染治療，包括 金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、梭狀芽孢菌屬、棒狀桿菌等，尤其在控制耐藥金黃色葡萄 球菌感染方面起了重要的作用；同時，該藥也可抗多種厭氧菌。夫西地酸是通過抑制細(xì)菌延 長因子G(FE-G)的功能而影響核糖體轉(zhuǎn)位、阻礙細(xì)菌蛋白合成而發(fā)揮抗菌機(jī)制的。此外，研 究表明夫西地酸還具有抗HIV和JCV病毒活性，但抗病毒作用機(jī)制并不清楚。除此之外，未見 夫西地酸抗其它病毒活性的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種夫西地酸或其藥用鹽的新用途，即抗腸病毒EV71和柯薩 奇病毒CVA16等病毒，從而用于制備治療手足口病的藥物。同時為手足口病藥物研發(fā)提供可 能的作用靶位和先導(dǎo)化合物，為進(jìn)一步結(jié)構(gòu)改造、獲得更強(qiáng)的抗病毒化合物提供工作基礎(chǔ)。
[0005] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0006] 本發(fā)明涉及夫西地酸或其藥用鹽在制備抗手足口病藥物中的新用途。夫西地酸又 稱梭鏈孢酸、褐霉素或留酸霉素。由真菌中的球形梭鏈孢菌(Fusidium coccineum)或某些 頭孢霉(Cephalosporium spp)產(chǎn)生。臨床實踐表明夫西地酸的毒副反應(yīng)小，兒童亦適合使 用。其藥用鹽多選用鈉鹽，即夫西地酸鈉。對夫西地酸或其藥用鹽進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，生成衍生 物，這些衍生物只要具有抗腸病毒EV71和柯薩奇病毒CAV16等病毒的能力，也都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0007] 本發(fā)明所述藥物是以夫西地酸或其藥用鹽為有效成分與藥學(xué)可接受的輔料組合 制成。所述藥學(xué)可接受的輔料包括:淀粉、微晶纖維素、蔗糖、糊精、乳糖、糖粉、葡萄糖、氯化 鈉、羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸鎂、微粉硅膠、維生素 C、半胱氨酸、檸檬 酸和亞硫酸鈉、木糖醇、麥芽糖、聚乙二醇、單糖漿、乙醇、丙二醇、植物油、甘露糖中的一種 或幾種。
[0008] 進(jìn)一步地，所述藥物可以是口服制劑、注射制劑或局部施用制劑。劑型的選擇和輔 料的用量均為本領(lǐng)域的常規(guī)選擇。為了達(dá)到更好的療效，針對嬰幼兒患者，優(yōu)先采用注射制 劑。
[0009] 本發(fā)明的有益效果：
[0010] 本發(fā)明表明夫西地酸具有顯著的體外抗EV71和CVA16的活性，當(dāng)Μ0Ι為0.01時，抑 制EV71和CVA16產(chǎn)毒量的EC50分別為3.56μΜ和5.41μΜ。進(jìn)一步的作用機(jī)制研究提示，夫西地 酸可能通過阻斷病毒RNA合成或病毒蛋白的合成或加工而發(fā)揮抗腸病毒作用的。目前臨床 表明夫西地酸的臨床副反應(yīng)少、毒性低、安全性高，是一類可用于兒童的抗感染用藥。鑒于 手足口病患者群主要為嬰幼兒，因此，夫西地酸具有開發(fā)為治療手足口病的藥物或先導(dǎo)化 合物的潛在應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0011]圖1流式分析夫西地酸對EV71-GFP所攜帶報告基因 GFP表達(dá)的影響及抗病毒活性。 將EV71-GFP按Μ0Ι = lPFU/cel 1感染Vero細(xì)胞后，去除感染液，加入含有不同濃度夫西地酸 的培養(yǎng)基。37°C培養(yǎng)18-20h后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的GFP熒光表達(dá)情況，以未加藥物的 GFP陽性細(xì)胞率作為100%，計算經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞GFP相對陽性率，數(shù)值為三次重復(fù)實驗 的平均值土 SD。流式圖為三次獨立重復(fù)實驗中的一次。
[0012] 圖2通過產(chǎn)毒量減少(virus titer reduction assay)分析夫西地酸的抗病毒活 性。將 EV71-MZ201405 和 CVA16-MZ201509(M0I = 0.01PFU/cell)分別與 RD 細(xì)胞孵育 lh 后去除 病毒上清，添加含有不同濃度夫西地酸的培養(yǎng)基，藥物濃度呈倍比稀釋；以未加藥物的感染 細(xì)胞為對照。感染后48h后收集上清，采用空斑法測定病毒滴度。將對照細(xì)胞上清測得的病 毒滴度設(shè)定為100%，經(jīng)藥物處理的細(xì)胞上清中的相對病毒滴度（％ )=(對照組病毒滴度-藥物處理組病毒滴度)/對照組病毒滴度X 100%。每種藥物濃度下的相對病毒滴度百分比 為三次重復(fù)實驗的平均值土SD。
[0013]圖3夫西地酸加入時間對產(chǎn)毒量的影響。將EV71-MZ感染RD細(xì)胞(M0I = 5)，分別在 感染前l(fā)h(-lh)及感染后他、111、211、411、611及811加入10(^1夫西地酸，以未加藥物的感染細(xì)胞 為對照，于感染后l〇h收集上清并通過空斑法測定病毒滴度，將對照組上清的病毒滴度設(shè)定 為100%，計算藥物處理組的相對產(chǎn)毒量。每種加藥時間下的相對病毒量百分比為三次重復(fù) 實驗的平均值土SD。
[0014] 圖4夫西地酸對腸病毒RNA合成的影響。將EV71-MZ201405感染RD細(xì)胞(M0I = 5)后 立即加入100μΜ夫西地酸，以未加藥物的細(xì)胞作為對照，分別于感染后2h、4h、6h及8h提取總 RNA，通過反轉(zhuǎn)錄-定量PCR(RT-QPCR)測定病毒RNA水平。以GAPDH mRNA水平為內(nèi)參，將2h時 對照細(xì)胞的病毒RNA相對豐度設(shè)定為1。實驗重復(fù)三次。
【具體實施方式】
[0015]為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本 發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016]藥品與試劑
[0017]本發(fā)明所測試的夫西地酸購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；用DMS0配制成濃度為 25.6mM的藥物貯存液;使用時用含10 %血清的DMEM培養(yǎng)基依次進(jìn)行2倍稀釋，使用終濃度分 別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25以]?。試劑包括 ：1\?85(似(：188/1，1((：10.28/ L，Na2HP042.72g/L，NaH 2P〇424g/L，pH 7.2)，DMEM(Gibco)，胎牛血清（Sigma)，0.05% Trypsin-EDTA(GIbC〇)，多聚甲醛(生工生物），結(jié)晶紫(珠海貝索生物技術(shù)有限公司），MTT (Sigma)，DMS0(Sigma)，Trizol reagent(Invitrogen)，PrimeScript RT reagent Kit (Takara),TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金）。
[0018] 細(xì)胞及病毒株
[0019] 293A-SCARB2細(xì)胞穩(wěn)定組成型表達(dá)EV71的天然受體SCARB2(human scavenger receptor class B,member 2,清道夫受體B2);橫紋肌肉瘤RD細(xì)胞和非洲綠猴腎Vero細(xì)胞 對EV71高度敏感，廣泛用來分離、擴(kuò)增EV71和CVA16AV71-GFP為攜帶報告基因 GFP的從北京 地區(qū)分離的毒株;EV71-MZ210405是從廣東地區(qū)重癥手足口病患兒分離得到的高致病性腸 病毒EV71毒株;CAV16-MZ210509是從廣東地區(qū)重癥手足口病患兒分離得到的高致病性柯薩 奇病毒16毒株。
[0020]儀器
[0021] 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，倒置顯微鏡(Leica)，倒置熒光顯微鏡(Leica)，流式細(xì)胞儀 (BD Accuri?C6)，定量PCR儀（BioRad)。
[002