活化素-actrii拮抗劑及在提高紅細胞水平中的用圖
【專利說明】活化素 -ACTRI I拮抗劑及在提高紅細胞水平中的用途
[0001 ]本申請為分案申請，原申請的申請日為2 0 0 7年1 2月1 8日，申請?zhí)枮?200780051416.4(PCT/US2007/025868)，發(fā)明名稱為"活化素-ACTRII拮抗劑及在提高紅細 胞水平中的用途"。
[0002] 相關(guān)申請
[0003] 本申請要求于2006年12月18日提交的美國臨時專利申請60/875,682的權(quán)益，該申 請全文在此引入作為參考。
【背景技術(shù)】
[0004] 成熟的紅細胞(或紅血球)負責(zé)脊椎動物循環(huán)系統(tǒng)中的氧的運輸。紅細胞攜帶高濃 度的血紅蛋白，血紅蛋白是一種蛋白，其在相對高的氧分壓(P〇 2)下在肺中與氧結(jié)合，并將 氧傳遞至具有相對較低P〇2的身體部分。
[0005] 成熟的紅細胞可在稱為紅細胞生成的過程中由多能性造血干細胞生成。在出生后 的個體中，紅細胞生成主要在骨髓和脾的紅髓中進行。各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的協(xié)同作用控制 細胞增殖、分化、存活和死亡的平衡。在正常條件下，紅細胞以可維持體內(nèi)恒定的紅細胞量 的速率生成，且在響應(yīng)各種刺激(包括上升或下降的氧張力或組織需求）中可提高或減少其 生成。紅細胞生成的過程開始于譜系定向前體細胞，并通過一系列的不同前體細胞類型進 行。網(wǎng)織紅細胞紅細胞生成的最終階段出現(xiàn)為網(wǎng)織紅細胞釋放進入血流，并失去它們的線 粒體和核糖體，同時呈現(xiàn)成熟紅細胞的形態(tài)。在血液中網(wǎng)織紅細胞水平的上升或者網(wǎng)織紅 細胞:紅細胞比例的上升標志著紅細胞生成速率的上升。
[0006] 促紅細胞生成素(Epo)被廣泛認為是出生后脊椎動物中最重要的紅細胞生成陽性 調(diào)節(jié)劑。Epo可響應(yīng)減少的組織氧張力（低氧）和低紅細胞水平或低血紅蛋白水平來調(diào)節(jié)補 償性紅細胞生成。在人體內(nèi)，上升的Epo水平可通過刺激骨髓和脾中紅系祖細胞的生成而促 進紅細胞的形成。在小鼠中，Epo主要增加脾中的紅細胞生成。
[0007] 醫(yī)師們采用了各種形式的重組Epo來增加各種臨床環(huán)境中的紅細胞水平，特別針 對貧血的治療。貧血是一種具有較寬定義的病癥，其特征在于血液中的血紅蛋白或紅細胞 低于正常水平。在部分案例中，貧血是由紅細胞的生成或存活的原發(fā)性疾病所引起的。更常 見情況下，貧血繼發(fā)于其它系統(tǒng)的疾病（Weatherall&Provan(2000)Lancet 355,1169-1175)。貧血可由紅細胞生成速率下降或破壞速率上升所導(dǎo)致，或者由因出血引起的紅細胞 丟失所導(dǎo)致。貧血可由多種疾病引起，所述疾病包括，例如，慢性腎功能衰竭、骨髓增生異常 綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以及骨髓移植。
[0008] 以Epo進行治療通常可導(dǎo)致健康人在一周以上的期間內(nèi)約l_3g/dL的血紅蛋白上 升。當施用至貧血個體時，該治療方案通?？商峁┭t蛋白和紅細胞水平的大量上升，并使 得生活質(zhì)量改善和存活時間延長。Epo并非一律有效，許多個體甚至在高劑量下仍然不顯療 效（Horl等人（2000)Nephrol Dial Transplant 15,43_50)。超過50% 以上的癌癥患者對 Epo的響應(yīng)不足，大約10%的末期腎病患者具有低響應(yīng)性(Glaspy等人（1997)J Clin Oncol 15，1218-1234;Demetri等人（1998)J Clin Oncol 16,3412-3425)，以及不到10%的骨髓增 生異常綜合征患者能夠順利響應(yīng)(Estey(2003)Curr Opin Hematol 10,60-67)。許多因素， 包括炎癥、鐵和維生素缺乏、透析不充分、鋁毒性以及甲狀旁腺功能亢進可導(dǎo)致較差的治療 應(yīng)答，對Epo耐受的分子機制仍然不清楚。
[0009]因此，本公開的一個目標是提供增加患者紅細胞水平的替代性組合物和方法。 [0010]發(fā)明綜述
[0011] 部分而言，本公開顯示活化素拮抗劑以及ActRIIa和ActRIIb拮抗劑可用于增加紅 細胞和血紅蛋白水平。具體來說，本公開顯示ActRIIa的可溶形式作為活化素的抑制劑，且 當其在體內(nèi)施用時提高血液中的紅細胞水平。對Ac tRII b的可溶形式觀察到較為溫和的作 用，其以比可溶ActRIIa更低的親和性結(jié)合活化素 A。盡管可溶ActRIIa和ActRIIb可能通過 活化素拮抗以外的機制影響紅細胞水平，本公開仍然顯示了可在活化素拮抗或ActRII拮抗 或者兩者的基礎(chǔ)上選擇所需要的治療劑。該種藥劑被統(tǒng)稱為活化素-ActRII拮抗劑。因此， 在某些實施方式中，本公開提供了使用活化素-ActRII拮抗劑在有此需要的患者中增加患 者紅細胞和血紅蛋白水平并治療與低紅細胞或血紅蛋白水平相關(guān)的疾病的方法，該活化 素 -Ac tRII拮抗劑包括，例如，活化素-結(jié)合ActRIIa多肽，活化素-結(jié)合ActRIIb多肽，抗活化 素抗體，抗ActRIIa抗體，抗ActRIIb抗體，革E向活化素、ActRIIb或ActRIIa的小分子和適體 以及減少活化素、ActRIIb或ActRIIa的表達的核酸。如美國專利申請11/603,485(在此引入 作為參考)所述，活化素-ActRIIa拮抗劑可用于促進骨生長和提高骨密度。如本文所述，該 種拮抗劑對紅細胞水平的作用相對該種拮抗劑對骨的作用更為快速并在更低劑量下產(chǎn)生。 因此，在某些實施方式中，本公開提供使用活化素-ActRIIa拮抗劑提高紅細胞或血紅蛋白 水平，而不引起骨密度明顯升高的方法。例如，一種方法可引起小于3%、5%、10%或15%的 骨密度增加。這種選擇性作用可通過使用例如較低劑量活化素-ActRIIa拮抗劑、較低給藥 頻率而達到，或通過使用在經(jīng)計算可提供較低的血清濃度的劑量和頻率的具有較短血清半 衰期的活化素-ActRIIa拮抗劑而達到。
[0012] 在某些方面，本公開提供包含可溶、活化素-結(jié)合ActRII多肽的多肽，其結(jié)合活化 素。所述活化素結(jié)合多肽可以是ActRIIa多肽或ActRIIb多肽。ActRII多肽可配制成藥物制 劑，其包含該活化素-結(jié)合ActRII多肽和藥學(xué)上可接受的載體。該活化素-結(jié)合ActRII多肽 可以小于1微摩爾或小于100、10或1納摩爾的K D與活化素結(jié)合?？蛇x地，該活化素-結(jié)合 ActRII多肽相對于結(jié)合⑶F11和/或⑶F8選擇性地結(jié)合活化素，并可選地以比結(jié)合⑶F11和/ 或GDF8至少低10倍、20倍或50倍的K D結(jié)合活化素。盡管不希望受限于特定的作用機制，預(yù)期 活化素抑制相對于GDF11/GDF8抑制的選擇性程度解釋了對骨或紅細胞生成的作用，且對肌 肉沒有一致可測的作用。在許多實施方式中，會選擇ActRII多肽，從而在達到對紅細胞水平 的所需作用的劑量下，引起肌肉中小于15%、小于10%或小于5%的增長。該組合物通過尺 寸排阻層析估計相對于其它多肽成分可具有至少95%的純度，可選地，該組合物具有至少 98%的純度。用于該種制備的活化素-結(jié)合ActRIIa多肽可以是本文所述的任意該種多肽， 例如具有選自SEQ ID N0:2、3、7或12的氨基酸序列，或具有與選自SEQ ID N0:2、3、7、12或 13的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%或99%的同一性的氨基酸序列的多 肽?；罨?結(jié)合ActRIIa多肽可包含天然ActRIIa多肽的功能性片段，例如具有選自序列 SEQIDN0:l-3或序列SEQIDN0:2的至少10、20或30個氨基酸，缺失C-末端10至15個氨基 酸（"尾部"）的功能性片段。用于該種制備的活化素-結(jié)合ActRIIb多肽可以是本文所述的任 意該種多肽，例如具有選自SEQ ID NO: 16、17、20或21的氨基酸序列，或具有與選自SEQ ID 勵:16、17、20或21的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%或99%的同一性的氨 基酸序列的多肽?；罨?結(jié)合ActRIIb多肽可包含天然ActRIIb多肽的功能性片段，例如具 有選自SEQ ID NO: 15-17的至少10、20或30個氨基酸或缺失C-末端10至15個氨基酸（"尾 部"）的序列例如SEQ ID NO: 17的功能性片段。
[0013] 可溶、活化素-結(jié)合ActRII多肽可包括相對天然存在的ActRII多肽在氨基酸序列 (例如，在配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域）中的一個或多個替換。例如，在W0 2006/012627中的第59-60頁 和第55-58頁(在此引入作為參考)分別提供了變化的ActRIIa和ActRIIb多肽的實例。在氨 基酸序列中的變化可以例如，在其在哺乳動物、昆蟲或其它真核細胞中生成時改變多肽的 糖基化，或者相對于天然存在的ActRII多肽改變多肽的蛋白水解裂解。
[0014] 活化素-結(jié)合ActRII多肽可以是一種融合蛋白，其有作為一種結(jié)構(gòu)域的ActRII多 肽(例如，ActRIIa或ActRIIb的配體-結(jié)合部分)和提供所需性能(例如改善的藥物代謝動力 學(xué)、更簡單的純化、靶向特定的組織等）的一種或多種其它結(jié)構(gòu)域。例如，融合蛋白的結(jié)構(gòu)域 可增強體內(nèi)穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期、攝取/施用、組織定位或分布、蛋白復(fù)合物的形成、該融合 蛋白的多聚化和/或純化中的一種或多種?；罨?結(jié)合ActRII融合蛋白可包含能提供所需 性能(例如改善的藥物代謝動力學(xué)、提高的溶解度或提高的穩(wěn)定性)的免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域 (野生型或突變)或血清白蛋白或其它多肽部分。在優(yōu)選的實施方式中，ActRII-Fc融合包含 在Fc結(jié)構(gòu)域和胞外ActRII結(jié)構(gòu)域之間的相對非結(jié)構(gòu)化的接頭。該非結(jié)構(gòu)化的接頭可對應(yīng)于 ActRII的胞外結(jié)構(gòu)域的C-末端的約15個氨基酸的非結(jié)構(gòu)化區(qū)（"尾部"），或者它可以是相對 不含二級結(jié)構(gòu)的1、2、3、4或5個氨基酸的人工序列或長度在5和15、20、30、50或更多氨基酸 的人工序列，或者兩者的混合物。接頭可富含甘氨酸或脯氨酸殘基，并可以例如，包含蘇氨 酸/絲氨酸和甘氨酸的單獨序列或蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的重復(fù)序列（例如，TG4(SEQ ID NO: 22)或SG4(SEQ ID NO: 23)單態(tài)或重復(fù)）。融合蛋白可包含純化子序列，例如表位標記、 FLAG標記、聚組氨酸序列和GST融合?？蛇x地，可溶ActRII多肽包含選自如下的一種或多種 修飾的氨基酸殘基:糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙?；被?、生 物素化氨基酸、與脂質(zhì)部分綴合的氨基酸以及與有機衍生劑綴合的氨基酸。藥物制劑還可 包含一種或多種附加化合物，例如可用于治療骨病的化合物。優(yōu)選地，藥物組合物基本不含 熱原。一般而言，優(yōu)選在哺乳動物細胞系中表達ActRII蛋白，其合適地介導(dǎo)ActRII蛋白的天 然糖基化，從而減少患者中的不利免疫應(yīng)答的可能性。人和CH0細胞系已被成功使用，也可 預(yù)期使用其它常見的哺乳動物表達系統(tǒng)。
[0015] 本文所述的ActRIIa蛋白特指具有所需特性的ActRIIa-Fc(在ActRIIa部分和Fc部 分之間具有最小接頭的形式），其包括在動物模型中相對GDF8/GDF11選擇性結(jié)合活化素、高 親和性配體結(jié)合和大于兩周的血清半衰期。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了ActRII-Fc多 肽和包含該多肽和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物制劑。
[0016] 在某些方面，本公開提供了編碼可溶活化素-結(jié)合ActRII多肽（例如ActRIIa或 ActRIIb多肽）的核酸。分離的多聚核苷酸可包含例如上述的可溶的、活化素-結(jié)合ActRII多 肽的編碼序列。例如，分離的核酸可包含編碼ActRII的胞外結(jié)構(gòu)域(例如，配體-結(jié)合結(jié)構(gòu) 域)的序列以及編碼ActRII的部分或全部跨膜結(jié)構(gòu)域和/或細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，除定位在該跨膜 結(jié)構(gòu)域或細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中、或定位在該胞外結(jié)構(gòu)域和該跨膜結(jié)構(gòu)域或細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的 終止密碼子外的序列。例如，分離的多聚核苷酸可包含全長ActRIIa多聚核苷酸序列(例如， SEQIDN0:4或5)或全長ActRIIb多聚核苷酸序列（例如SEQIDN0:18)，或部分截短的 ActRIIa或ActRIIb形式，所述分離的多聚核苷酸進一步包含在3 末端之前至少六百個核 苷酸處或其它位置的轉(zhuǎn)錄末端密碼子，從而使該多聚核苷酸的翻譯形成可選地融合至全長 ActRII的截短部分的胞外結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的ActRIIa的核酸序列為SEQ ID NO: 14。此處披露的 核酸可操作地連接至表達啟動子，且該公開提供了用這種重組多聚核苷酸轉(zhuǎn)化的細胞。所 述細胞優(yōu)選為哺乳動物細胞，例如CH0細胞。
[0017]在某些方面，本公開提供了制備可溶的、活化素-結(jié)合ActRII多肽的方法。所述方 法可包括在合適的細胞，例如中國倉鼠卵巢(CH0)細胞中表達此處披露的任意核酸(例如， SEQ ID NO:4、5、14、18或19)。這種方法可包括:a)在適于所述可溶ActRII多肽表達的條件 下培養(yǎng)細胞，其中所述細胞以可溶ActRII表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化；和b)回收如此表達的可溶 ActRII多肽?？扇蹵ctRII多肽可作為粗制品、部分純化或高度純化的組分回收。純化可通過 一系列純化步驟實現(xiàn)，所述步驟包括例如，任意順序的如下步驟中的一種、兩種或三種或多 種:蛋白A色譜、陰離子交換色譜(例如，Q瓊脂糖）、疏水作用色譜(例如，苯基瓊脂糖）、尺寸 排阻層析以及陽離子交換色譜。
[0018] 在某些方面，本文披露的活化素-ActRII拮抗劑，例如，可溶的、活化素-結(jié)合 ActRIIa多肽或可溶的、活化素-結(jié)合ActRIIb多肽，可用于在對象中促進紅細胞生成或增加 紅細胞水平的方法中。在某些實施方式中，本公開提供了在有此需要的患者中治療與低紅 細胞數(shù)或低血紅蛋白水平相關(guān)的疾病(例如，貧血）的方法。方法可包括向有此需要的對象 施用有效量的活化素-ActRII拮抗劑。在某些方面，所述公開提供了活化素-ActRII拮抗劑 在制備用于治療本文披露的疾病或病癥的藥物中的用途。
[0019] 在某些方面，所述公開提供了鑒定刺激紅細胞生成的藥劑的方法。所述方法包括： a)鑒定結(jié)合ActRII多肽的活化素或配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的測試藥劑；以及b)評估所述藥劑對 紅細胞、血紅蛋白水平和/或紅細胞前體水平(例如，網(wǎng)織紅細胞水平）的作用。
【附圖說明】
[0020] 圖1顯示了在CH0細胞中表達的ActRIIa-hFc的純化。該蛋白純化為通過排阻柱顯 示的單獨的、輪廓清晰的峰(上圖）和Coomassie染色的SDS-PAGE(下圖）（左泳道:分子量標 準；右泳道:ActRIIa-hFc)。
[0021 ] 圖2顯示了通過BiaCore?測定的ActRIIa-hFc與活化素和⑶F-l 1的結(jié)合。
[0022]圖3顯示了 ActRIIa-hFc對雌性非人靈長動物的紅細胞數(shù)的影響。在第0天、第7天、 第14天和第21天以安慰劑或1 mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的ActRIIa-hFc治療雌性短尾猴 (四組，每組五只猴）。圖3A顯示紅細胞(RBC)數(shù)。圖3B顯示血紅蛋白水平。統(tǒng)計顯著性是相對 于每個治療組的基線。在第57天，每個組保留兩只猴子。
[0023]圖4顯示了 ActRIIa-hFc對雄性非人靈長動物的紅細胞數(shù)的影響。在第0天、第7天、 第14天和第21天以安慰劑或lmg/kg、10mg/kg或30mg/kg的ActRIIa-hFc治療雄性短尾猴（四 組，每組五只猴）。圖4A顯示紅細胞(RBC)數(shù)。圖4B顯示血紅蛋白水平。統(tǒng)計顯著性是相對于 每個治療組的基線。在第57天，每個組保留兩只猴子。
[0024]圖5顯示了 ActRIIa-hFc對雌性非人靈長動物的網(wǎng)織紅細胞數(shù)的影響。在第0天、第 7天、第14天和第21天以安慰劑或lmg/kg、10mg/kg或30mg/kg的ActRIIa-hFc治療短尾猴（四 組，每組五只猴）。圖5A顯示絕對網(wǎng)織紅細胞數(shù)。圖5B顯示網(wǎng)織紅細胞相對于RBC的百分比。 統(tǒng)計顯著性是相對于每個組的基線。在第57天，每個組保留兩只猴子。
[0025]圖6顯示了 ActRIIa-hFc對雄性非人靈長動物的網(wǎng)織紅細胞數(shù)的影響。在第0天、第 7天、第14天和第21天以安慰劑或lmg/kg、10mg/kg或30mg/kg的ActRIIa-hFc治療短尾猴（四 組，每組五只猴）。圖6A顯示絕對網(wǎng)織紅細胞數(shù)。圖6B顯示網(wǎng)織紅細胞相對于RBC的百分比。 統(tǒng)計顯著性是相對于每個組的基線。在第57天，每個組保留兩只猴子。
[0026]圖7顯示了實施例5中的人類臨床試驗所得的結(jié)果，其中曲線下面積（AUC)和 ActRIIa-hFc的施用劑量具有線性關(guān)系，而與ActRIIa-hFc是通過靜脈（IV)施用還是皮下 (SC)施用無關(guān)。
[0027] 圖8顯示了 IV或SC施用的患者中的ActRIIa-hFc血清水平的比較。
[0028] 圖9顯示了響應(yīng)不同劑量水平的ActRIIa-hFc的骨堿性磷酸酶(BAP)水平。BAP是合 成代謝骨生長的標記。
[0029] 圖10顯示了來自實施例5所述人臨床試驗的血細胞比容水平基線的中值變化。 ActRIIa-hFc以所示的劑量靜脈(IV)施用。
[0030] 圖11顯示了來自實施例5所述人臨床試驗的血紅蛋白水平基線的中值變化。 ActRIIa-hFc以所示的劑量靜脈(IV)施用。
[0031 ]圖12顯示了來自實施例5所述人臨床試驗的RBC(紅細胞）數(shù)基線的中值變化。 ActRIIa-hFc以所示的劑量靜脈(IV)施用。
[0032]圖13顯示了來自實施例5所述人臨床試驗的網(wǎng)織紅細胞數(shù)基線的中值變化。 ActRIIa-hFc以所示的劑量靜脈(IV)施用。
[0033] 發(fā)明詳述
[0034] 1.綜述
[0035]轉(zhuǎn)化生長因子-iKTGF-β)超家族包含各種具有共同的序列元件和結(jié)構(gòu)基序的生長 因子。這些蛋白已知可同時對脊椎動物和無脊椎動物中的各種各樣的細胞類型產(chǎn)生生物效 應(yīng)。該超家族的成員在胚胎發(fā)育過程中在圖式形成和組織特異性中具有重要的功能，并能 影響多種分化過程，包括脂肪形成、肌細胞形成、軟骨形成、心臟發(fā)生、血細胞形成、神經(jīng)發(fā) 生以及上皮細胞分化。該家族被分為兩大分支:BMP/GDF和TGF-iV活化素 /BMP 10分支，其成 員具有不同的，通常是互補的作用。通過調(diào)節(jié)TGF-β家族成員的活性，通常可能引起有機體 的明顯生理變化。例如，皮爾蒙特與比利時藍牛繁殖攜帶⑶F8 (也稱為肌肉抑制素)基因的 功能喪失突變，其導(dǎo)致肌肉量的明顯增加。Grobet等人，Nat Genet. 1997，17(1): 71-4。此 外，在人類體內(nèi)，滅活GDF8等位基因與肌肉量的上升相關(guān)，且據(jù)報道與異常的力量相關(guān)。 Schuelke等人，N Engl J Med 2004,350:2682-8。
[0036] 活化素是二聚多肽生長因子，其屬于TGF-β超家族。存在三種主要的活化素形式 (A，B和AB)，其為兩種密切相關(guān)的β亞基的同源/異源二聚體(分別為和
[0037] 人基因組還編碼活化素 C和活化素 Ε，其主要在肝中表達，同樣已知包括ik或恥的 異源二聚體形式。在TGF-β超家族中，活化素是獨特的和多功能的因子，它能刺激卵巢和胎 盤細胞中的激素生成，支持神經(jīng)元細胞存活，根據(jù)細胞類型積極或消極影響細胞周期進展， 并至少在兩棲動物胚胎中誘導(dǎo)中胚層的分化（DePaolo等人，1991，Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson 等人，1997, Curr Biol .7:81-84 ; Woodruff，1998, Biochem Pharmacol. 55:953-963)。此外，業(yè)已發(fā)現(xiàn)從刺激后的人單核白血病細胞中分離的紅細胞分 化因子(EDF)與活化素 A相同（Murata等人，1988，PNAS，85:2434)。業(yè)已表明活化素 A促進骨 髓中的紅細胞生成。在多種組織中，活化素信號傳導(dǎo)被它的相關(guān)異源二聚體抑制素所拮抗。 例如，在從腦垂體釋放促卵泡激素(FSH)的過程中，活化素促進FSH分泌和合成，而抑制素阻 止FSH的分泌和合成。其它可調(diào)節(jié)活化素生物活性和/或結(jié)合活化素的蛋白包括卵泡抑素 (FS)、卵泡抑素相關(guān)蛋白（FSRP)和α2_巨球蛋白。
[0038] TGF-β信號受到I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的雜聚肽復(fù)合物所介導(dǎo)，其在 受到配體刺激時磷酸化和激活下游Smad蛋白（Massagu6,2000，Nat.Rev.Mol .Cell Biol · 1: 169-178)。這些I型和II型受體為跨膜蛋白，由富含半胱氨酸區(qū)的配體-結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域、跨 膜結(jié)構(gòu)域、具有預(yù)定的絲氨酸/蘇氨酸特異性的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域所組成。I型受體為信號傳導(dǎo) 所必需；在結(jié)合配體和I型受體的表達中需要II型受體。I和II型活化素受體在配體結(jié)合后 形成穩(wěn)定的復(fù)合物，導(dǎo)致I型受體被Π 型受體磷酸化。
[0039] 兩種相關(guān)的II型受體(ActRII)，ActRIIa和ActRIIb已被鑒定為活化素的II型受體 (Mathews和Vale，1991，Cell 65:973-982;Attisano等人，1992，Cell 68:97-108)。除了活 化素外，ActRIIa和ActRIIb能夠與多種其它的TGF-β家族蛋白（包括BMP7、Nodal、GDF8和 ⑶F11)進行生化形式的相互作用（Yamashita等人，1995, J.Cell Biol .130:217-226;Lee和 McPherron，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.98:9306-9311;Yeo和Whitman，2001，Mol.Cell 7: 949-957;Oh等人，2002，Genes Dev. 16:2749-54) ALK4是活化素(特別是活化素 A)的主要的 I型受體，而ALK-7也可用作活化素(特別是活化素 B)的受體。
[0040]如本文所證實，相對其它TGF-β家族成員（例如⑶F8或⑶FI 1)明顯優(yōu)先結(jié)合活化素 A的可溶ActRIIa多肽(sActRIIa)能夠有效提高體內(nèi)紅細胞水平。然而不希望受限于任何具 體機制，假定在這些研究中所用的具體sActRIIa構(gòu)建體所顯示的極強活化素結(jié)合(皮摩爾 解離常數(shù)），預(yù)期sActRIIa的作用主要由活化素拮抗劑作用所引起。不考慮機制，從本公開 可顯而易見地看到:ActRIIa-活化素拮抗劑提高了嚙齒動物、猴和人的紅細胞水平。應(yīng)指 出：血細胞生成是一種復(fù)雜的過程，它受到多種因素的調(diào)節(jié)，包括促紅細胞生成素、G-CSF和 鐵的體內(nèi)平衡。術(shù)語"提高紅細胞水平"和"促進紅細胞形成"指臨床觀察的測量指標，例如 血細胞比容、紅細胞計數(shù)和血紅蛋白測量，其意在對該種變化發(fā)生的機制保持中立。
[0041 ]同樣如本文所示，可溶ActRIIb多肽(sActRIIb)有效提高體內(nèi)網(wǎng)織紅細胞的水平， 該作用預(yù)期在更長的時間期間內(nèi)可引起血細胞比容水平升高。
[0042]本文報道的針對非人類靈長動物的數(shù)據(jù)可在小鼠、大鼠和人中重復(fù)，因此，本公開 提供了采用ActRII多肽和其它活化素 -ActRII拮抗劑在從嚙齒動物到人類的哺乳動物中促 進紅細胞生成和提高紅細胞水平的方法?；罨?-ActRII拮抗劑包括例如，活化素-結(jié)合的 可溶ActRIIa多肽，活化素-結(jié)合的可溶ActRIIb多肽，結(jié)合活化素(特別是活化素 A和B亞基， 也稱為Μ和βΒ)以及破壞ActRIIa和/或ActRIIb結(jié)合的抗體，結(jié)合ActRIIa并破壞活化素結(jié) 合的抗體，結(jié)合ActRIIb并破壞活化素結(jié)合的抗體，選擇用于活化素、ActRIIb或ActRIIa結(jié) 合的非抗體蛋白（該種蛋