素或綠茶多酚;蕓香苷類(rutin)如蕓香苷(提取物）、斛皮 素、蕓香苷酶分解產(chǎn)物、酶處理蕓香苷(提取物)和酶處理異斛皮素;酶分解蘋果提取物;乳 化劑如蔗糖脂肪酸脂、失水山梨醇脂肪酸脂、酶處理卵磷脂、酶分解卵磷脂和皂角苷等。
[0067] 本發(fā)明的肥胖抑制組合物，特別是當(dāng)經(jīng)口服用時(shí)，可以改善身體狀況，使得脂肪容 易分解，并且可以增強(qiáng)通過飲食控制或鍛煉獲得的飲食效果。此外，可以獲得在正常條件下 改善脂肪分解能力的效果。因此，本發(fā)明可以最佳地用作例如飲食食物、減重食物、運(yùn)動(dòng)療 法用食物、肥胖治療食物和用于具有由于疾病、運(yùn)動(dòng)功能障礙或高齡等的極低身體活動(dòng)的 人的食物或飲料。本發(fā)明還可以用作標(biāo)記有適用于飲食、美容護(hù)理或肥胖改善的適應(yīng)癥的 食物和飲料。此外，由于防止產(chǎn)生肥大性脂肪細(xì)胞的效果所致，本發(fā)明可以有助于預(yù)防和改 善肥胖癥、糖尿病和多種相關(guān)疾病，并且還可以用作口服組合物、藥品、食物和飲料等，用于 預(yù)防和改善肥胖癥、代謝綜合征(metabolic syndrome)、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、異常葡萄 糖耐量（abnormal glucose t ο 1 eran c e )、高血壓（hy p er t en s i on )、高月旨血癥 (hyperlipidemia)、高中性脂血癥（hyper neutral lipemia)、高膽固醇血癥 (hypercholesterolemia)、肝病(hepatic disease)等。此外，本發(fā)明還可以用作口服組合 物、藥品、食物和飲料等，用于預(yù)防和改善肥胖癥和糖尿病的并發(fā)癥，如牙周病 (periodontal diseases)(牙銀炎（gingivitis)和牙周炎(periodontitis))，并且還可以 用作標(biāo)記有適合于預(yù)防或改善上述疾病的適應(yīng)癥的口服組合物(包括食品和飲料）。 實(shí)施例
[0068]在以下詳細(xì)描述本發(fā)明；然而，本發(fā)明不限于以下實(shí)施例。下文中，除非另有說明， "％"表示"質(zhì)量％"。
[0069] 脂肪細(xì)胞中脂肪滴蓄積的抑制
[0070]使用前脂肪細(xì)胞(preadipocyte )3T3-L1細(xì)胞來評(píng)價(jià)抑制脂肪滴在脂肪細(xì)胞中的 蓄積的效果。該3T3-L1細(xì)胞分離自小鼠成纖維細(xì)胞，作為蓄積脂肪的細(xì)胞。因?yàn)樗鼈兪怯郎?細(xì)胞，它們可以在誘導(dǎo)分化之前作為成纖維細(xì)胞大量生產(chǎn)。此外，95 %以上的3T3-L1細(xì)胞可 以通過胰島素、地塞米松(dexamethasone)和3-異丁基-1-甲基黃噪呤（IBMX)分化成脂肪細(xì) 胞。
[0071] 培養(yǎng)基的制備
[0072] 使用的傳代培養(yǎng)基是傳代培養(yǎng)基A(DMEM(4.5g/L Glu)/(Sigma，葡萄糖，D5769)/ 10%BS(Gibco，16170)和1 %抗生素 (Gibco，抗生素-抗真菌的(Antibiotic-Antimycotic)， 15240-062))和傳代培養(yǎng)基 B(DMEM(4.5g/LGlu)/10%FBS(Biowest，S 1560)和1 %抗生素）。
[0073] 通過將 10-yg/mL 胰島素溶液(^1?)，093-06351)、0.25以]\1地塞米松（5丨81^，04902) 和0.11-mg/mL 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(5181^，15879)添加到傳代培養(yǎng)基8中制備所使用 的誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基。通過將5-yg/mL胰島素溶液添加到傳代培養(yǎng)基B中而制備所使用的促 進(jìn)分化的培養(yǎng)基。該誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基和促進(jìn)分化的培養(yǎng)基在使用之前制備。
[0074] 用于制備樣品的方法
[0075] 使用的橄欖苦苷是可得自Sigma的"橄欖苦苷"試劑。實(shí)驗(yàn)中，橄欖苦苷以使得最終 濃度為50μΜ的量使用。
[0076] 使用的羥基酪醇是可得自Sigma的"羥基酪醇"試劑。實(shí)驗(yàn)中，羥基酪醇以使得最終 濃度為25μΜ的量使用。
[0077] 使用的楊柳提取物是包括楊柳（含有選自瑞香柳（Sa 1 i X daphn〇 i de s)、紫皮柳 (Salix purpurea)、爆竹柳（Salix fragilis)、白柳（Salix alba)中的至少一種或多種的 植物混合物)的新芽的嫩枝的水提取物(干粉）。實(shí)驗(yàn)中，提取物用培養(yǎng)基稀釋以使最終濃度 為2.5、5、12.5、25、50、10(^P200yg/mL。
[0078] 使用的萊菔硫烷是可得自Sigma的"萊菔硫燒"試劑。實(shí)驗(yàn)中，制備100-mM DMS0溶 液，并用培養(yǎng)基稀釋。
[0079] 制備5-mM γ -阿魏酸酯（γ -orizanol)溶液并用培養(yǎng)基稀釋。
[0080] 用于培養(yǎng)細(xì)胞和添加樣品的方法
[0081] 必要量的3T3-L1 細(xì)胞（由Sumitomo Dainippon Pharma Co ·，Ltd ·制造;胚胎小鼠 (Embryo mouse))在傳代培養(yǎng)基A中生長。將細(xì)胞懸浮液（lmL)接種在膠原蛋白涂覆的培養(yǎng) 板（由 Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.制造 ；Sumilon CelltightC-1)中，使得濃度為 2·5χ 1〇4個(gè)細(xì)胞/孔。細(xì)胞在5%C02存在下在37°C下培養(yǎng)2天。之后，培養(yǎng)基用傳代培養(yǎng)基Β代替。匯 合生長之后，在傳代培養(yǎng)基Β中繼續(xù)培養(yǎng)約2天，并且培養(yǎng)基用誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基代替(第0 天）。在誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)細(xì)胞分化之后的48小時(shí)內(nèi)，培養(yǎng)基用促進(jìn)分化的培養(yǎng)基代 替(第2天）。從替代誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基的時(shí)間（第0天)至第7或8天，連續(xù)地添加每個(gè)樣品。樣 品根據(jù)示于表1至4中的組合物添加。
[0082] 用于使用油紅(Oil Red)將脂肪細(xì)胞染色的方法 [0083]-試劑的制備
[0084] 通過將10% (v/v)的福爾馬林添加到PBS(磷酸緩沖鹽水)并調(diào)整pH至7.4,然后在4 °C下儲(chǔ)存來制備冷的10 %福爾馬林/PBS。在本實(shí)驗(yàn)中，使用10 %中性緩沖福爾馬林溶液 (Wako,060-03845)。
[0085] 使用的染色溶液是0.5%油紅0/異丙醇溶液。通過振蕩將油紅0(Wako, 154-02072) 溶解在異丙醇中以制備飽和溶液。使用之前立即將〇. 5%油紅0/異丙醇溶液和蒸餾水以3:2 的比率混合(使用前制備）。
[0086] -染色方法
[0087]使用通過以上培養(yǎng)方法培養(yǎng)至第7或8天的在孔板中的3T3-L1細(xì)胞。將冷的10%福 爾馬林/PBS(0.5mL/孔)添加到含有培養(yǎng)基的孔板，并允許在室溫下放置。在移除培養(yǎng)基之 后，新加入冷的10%福爾馬林/PBS(0.5mL/孔），并允許在室溫下放置。在移除福爾馬林溶液 之后，用蒸餾水（lmL/孔）清洗孔板2或3次以完全移除剩余的蒸餾水。在用60%異丙醇 (0.5mL/孔)清洗孔板一次之后，以lmL/孔加入經(jīng)過濾的染色溶液，并允許在室溫下放置。在 染色之后，用60%異丙醇(0.5mL/孔)清洗孔板一次，并用蒸餾水（lmL/孔)清洗2或3次。將所 得物溶解在100%異丙醇(〇.5mL/孔）中，用石蠟?zāi)?parafilm)包裹板側(cè)面，并在20°C下溫和 振蕩20分鐘的同時(shí)進(jìn)行萃取。通過微板讀取器在0D 490nm下測(cè)量洗脫的異丙醇溶液。測(cè)量 結(jié)果作為相對(duì)于沒有添加任何組分的培養(yǎng)基中的脂肪細(xì)胞中的脂肪蓄積的量(將其視為 100)的值示出。表1至4示出結(jié)果。
[0088] 表 1
[0089]
[0090]
[0091]
[0092] 表 3
[0093]
[0094] 表 4
[0095]
[0096] 如表1和2中所示，當(dāng)將沒有添加任何組分的培養(yǎng)基中的脂肪細(xì)胞中的脂肪蓄積的 量視為1〇〇(比較例8a)時(shí)，在其中分別添加50μΜ橄欖苦苷和0.5至1.25μΜ萊菔硫烷的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞中的脂肪蓄積的相對(duì)量在1〇〇左右。這些結(jié)果與對(duì)照中的脂肪蓄積的量 幾乎是相同的。當(dāng)添加楊柳提取物(61.9;比較例4a)時(shí)，或當(dāng)添加 γ -阿魏酸酯（51.4;比較 例6a)時(shí)，每種情況中的脂肪蓄積的量小于對(duì)照（比較例8a)的量。相反，當(dāng)組合地加入橄欖 苦苷和萊菔硫烷時(shí)，脂肪蓄積的量在萊菔硫烷濃度為0.5至1.25μΜ下是79.6至74.0。因此， 確認(rèn)了抑制脂肪蓄積的效果。還發(fā)現(xiàn)通過以與橄欖苦苷(其單獨(dú)使用沒有效果)的組合使用 楊柳提取物可以增強(qiáng)脂肪蓄積效果。另一方面，橄欖苦苷與具有高脂肪蓄積抑制效果的γ _ 阿魏酸酯的組合使用沒有增強(qiáng)脂肪蓄積抑制效果。這些結(jié)果表明，通過使用楊柳提取物或 萊菔硫烷與橄欖苦苷組合可以顯著地抑制脂肪細(xì)胞中的脂肪蓄積。
[0097] 此外，如圖3和4中所示，在將沒有添加任何組分的培養(yǎng)基中的脂肪細(xì)胞中的脂肪 蓄積的量視為1〇〇(比較例lb)時(shí)，在其中添加每種組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞中的脂 肪蓄積的相對(duì)量為如下：當(dāng)添加25μΜ羥基酪醇，或者0.25或2.5μΜ萊菔硫烷時(shí)，在所有的情 況下的脂肪蓄積的量為100左右。這些結(jié)果與對(duì)照（比較例lb)中的脂肪蓄積的量幾乎是相 同的。當(dāng)添加37.5μΜ羥基酪醇、12.5yg/mL楊柳提取物、或0.5μΜ γ -阿魏酸酯時(shí)，在所有的情 況下的脂肪蓄積的量為75至80;它們的蓄積抑制效果比對(duì)照的高約25%。相反，當(dāng)組合地添 加羥基酪醇和萊菔硫烷時(shí)，，即使在當(dāng)它們以其中單獨(dú)的羥基酪醇和萊菔硫烷不表現(xiàn)出脂 肪蓄積效果的濃度進(jìn)行組合時(shí)，它們的抑制效果也高20至30%。此外，當(dāng)添加37.5μΜ羥基酪 醇、12.5yg/mL楊柳提取物、或0.5μΜ γ -阿魏酸酯時(shí)，它們的脂肪蓄積抑制效果比對(duì)照高約 25%。然而，當(dāng)將這些組分組合地添加時(shí)，羥基酪醇和楊柳提取物的組合顯示約50%的抑制 效果;而羥基酪醇和γ-阿魏酸酯的組合顯示76.7,其與單個(gè)組分的抑制效果相同。因此，羥 基酪醇和γ -阿魏酸酯的組合使用沒有增強(qiáng)脂肪蓄積抑制效果。這些結(jié)果表明，使用楊柳提 取物或萊菔硫烷與羥基酪醇的組合可以抑制脂肪細(xì)胞中的脂肪蓄積。
[0098] 以下描述根據(jù)本發(fā)明的肥胖抑制組合物(特別是口服組合物)的實(shí)施例的制劑;然 而，本發(fā)明不限于以下制劑實(shí)施例。除非另外指出，所顯示的量是質(zhì)量％。
[0099]
[0100]
[0101] 將每袋（pack)30g溶解在500mL水中用于飲用。對(duì)于每份飲料，橄欖苦苷的量是 54mg并且萊菔硫烷的量是0.6mg。
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