Complexin 1/2過表達重組載體的構建及應用
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明設及Complexin 1/2過表達重組載體的構建及應用，尤其設及Complexin 1/2基因及其過表達重組載體及其在制備治療阿爾茨海默病的藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默病(AD)是一種起病隱匿的進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，目前尚 無特別有效的治療手段。該病臨床上W記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損害、執(zhí)行 功能障礙W及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征，病因迄今未明。65歲W前發(fā)病者， 稱早老性癡呆;65歲W后發(fā)病者稱老年性癡呆。
[0003] 研究提示，Complexin 1/2在阿爾茨海默?。ˋD)患者腦中表達顯著下調，然而， Complexinl/2對AD發(fā)病的影響尚不清楚。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供Complexin 1/2過表達重組載體及其在制備治療阿爾茨海默 病的藥物中的應用。
[0005] 本發(fā)明的一個方面是提供Complexin 1和/或Complexin 2基因在制備治療阿爾茨 海默病的藥物中的應用，其中Complexin 1基因具有如序列1所示的堿基序列或者與序列1 具有95% W上，優(yōu)選99% W上同一'性的堿基序列；Complexin 2基因具有如序列2所示的堿 基序列或者與序列2具有95% W上，優(yōu)選99% W上同一性的堿基序列。
[0006] 本發(fā)明第二個方面是提供一種Complexin 1/2過表達重組載體，所述重組載體是 腺相關病毒重組載體，其含有序列表中序列1所示的堿基序列或與序列1具有95% W上，優(yōu) 選99% W上同一性的堿基序列和序列2所示的堿基序列或與序列2具有95% W上，優(yōu)選99% W上同一性的堿基序列。
[0007] 本發(fā)明的另一個方面是構建上述重組載體的方法，該方法包括下列步驟：
[000引（A )設計引物，其中C O m P 1 e X i n 1的引物序列為5'-GGAATTCTGAGGAACCAAGCCATCACC-3 '，5 '-CGGGATCGCTGACCCAATATCATTACTTC-3，
[0009] Complexin 2的引物序列為5'-GGAATTCTGCAGGATGGACTTCGTCATG-3'，5'-CGGGATCCGGAGGAGGATGGGTTACTTC-3 '；
[0010] 在上游引物的5'端前面加上保護堿基和EcoRI酶切位點序列(CGGAATTC)，下游引 物的5'端加上保護堿基和BamH I酶切位點序列(CGGGATCC);
[0011] (B)培養(yǎng)Ni3T3細胞，提取總RNA，將RNA反轉錄為CDNA;
[001 ^ (C似CDNA為模板，進行PCR擴增；
[OOU] (D)酶切目的基因和表達載體；
[0014] 化)將上述酶切的目的基因 CPLX 1/2連接到酶切載體pAAV-ires-GFP上形成重組 質粒 pAAV-CPLXl/2。
[0015] 本發(fā)明的再一個方面提供了 Complexin 1/2過表達重組載體在制備治療阿爾茨海 默病的藥物中的應用。
[0016]本研究通過構建Complexin 1/2過表達載體并在整體動物水平表達，確定 Complexin 1/2過表達對AD轉基因小鼠空間記憶損傷的影響。研究結果顯示，該重組載體在 整體動物水平成功高效表達，并顯著改善AD轉基因小鼠空間記憶的損傷。本發(fā)明不但為深 入研究Complexin 1/2的功能提供新的技術手段，同時為AD空間記憶損傷祀向基因治療提 供了新的候選策略。AD等疾病最為主要的分子改變?yōu)橛洃浵嚓P分子的表達下調，通過基因 手段促進Complexin 1/2的過度表達可為該類疾病提供治療策略。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點
[0018]本申請構建了新的Complexin 1/2過表達重組載體并在整體動物水平成功高效表 達，確定了Complexin I/II可有效阻止AD轉基因小鼠空間記憶的損傷，同時確定Complexin 1/2的高表達可顯著改善AD轉基因小鼠空間記憶的損傷。
[0019] 本申請的重組載體可用于祀向治療AD等記憶損傷相關的認知障礙疾病，為祀向治 療AD提供新的策略；此外，Complexin 1/2整體動物模型的成功建立可為深入研究 Complexin 1/2的生理功能提供新的技術手段。
【附圖說明】
[0020] 圖1是Ni3T3細胞提取總RNA電泳圖。
[0021] 圖2是PCR擴增CPLX 1/2基因；
[0022] 其中，M:DNA marker(2000bp)
[0023] I、2:Sample DM。
[0024] 圖3是菌落PCR鑒定圖；
[00巧]其中，M:DNA marker(2000bp)
[0026] I ~10:重組質粒 pAAV-CPLXl/2
[0027] ll:pAAV-ires-GFP。
[00%]圖4是目的基因片段的序列測定圖。
[0029] 圖5是CPLX1/2穩(wěn)定轉染細胞系在光鏡和巧光顯微鏡下的圖片；
[0030] 其中（A)C化X1/2穩(wěn)定轉染細胞系在光鏡下的圖片，圖中的標尺代表100皿；（B)運 是在巧光顯微鏡下的圖片，來自與(A)相同的視野。我們構建的CPLX1/2表達載體含有GFP結 構域，在表達CPLX1/2的同時可W表達GFP，因此陽性細胞可W發(fā)綠色巧光。圖中的標尺代表 100皿。
[0031 ]圖6是CPLX1/2過表達載體在小鼠海馬CA3區(qū)的表達情況。
[00創(chuàng)圖7是CPLX1/2對3xTg-AD小鼠學習能力的影響圖，其中圖7A是CPLX1/2對3xTg-AD 小鼠水迷宮逃避潛伏期的影響；圖7B是運動軌跡圖；圖7C是穿越平臺的次數(shù)；圖7D是探索平 臺所需時間；圖7E是目標象限活動路程占總路程百分比；圖7F是目標象限活動時間占總時 間百分比；圖7G是總路程；圖7H是平均速度。結果表示為平均值±標準誤，每組8-10只小鼠； 用t檢驗對結果進行統(tǒng)計學分析，. 05認為有統(tǒng)計學差別，p*<0.05VS Tg。
【具體實施方式】
[0033] W下通過具體實施例來說明本發(fā)明。
[0034] 實施例1
[00巧]Complexin 1/2過表達載體構建及應用
[0036] -、Complexin 1/2過表達載體構建
[0037] 1、序列獲得和引物設計
[003引從NCBI的Nucleotide數(shù)據(jù)庫中Genbank上找到小鼠 complexin l/2(CPLXl/2)基因 mRNA的CDS序列(Accession N0:NM_007756，NM_009946)，然后利用Oligo 7軟件分別選取各 個CDS兩端的部分序列進行分析，確定上下游引物，再在上游引物的5'端前面加上保護堿基 和EcoRI酶切位點序列（CGGAATTC)，下游引物的5'端加上保護堿基和BamH I酶切位點序列 (CGGGATCC)。引物委托上海生工生物有限公司進行合成，其序列見表1和表2所示：
[0039] 表1.CPLX 1基因擴增引物
[0041 ] 表2.CPLX 2基因擴增引物
[0043] 2、模板CDNA的獲得
[0044] 培養(yǎng)Ni3T3細胞(購自ATCC公司），用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)提取總RNA，具體方 法參考RNeasy Mini Kit(QIAgene)說明書，電泳檢測所提取的RNA，結果見圖1。
[0045] 3、將RNA反轉錄為cDNA
[0046] 各組細胞總RNA提取并進行純度測定后，采用反轉錄試劑盒（S叩er Script? Firs t-Strand)進行cDNA逆轉錄合成，方法見表2。
[0047] 表2反轉錄體系成分表
[0049] 37°C，15min;85°C，5s;4°C，w。反轉錄結束，加入90i^l的RNaseFree地20稀釋 cDNA，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br>[0050] 4、目的基因的獲得
[0051 ] 將新合成的引物加入TE buffer溶解，調整引物的最終濃度為10測，W上述CDNA為 模板，加引物，PrimeSTAR Max DNA Polymerase,
[0052] PCR反應體系（IOul): 漱; 如1 PrimcSTAR Max： 5ul
[005；3] 上游引物： OJul 下游引物； 0.3iU 模祗： 〇.4ul
[0054]設置PCR反應條件如下： m°C Smm 98 T： IOs
[0化5] 55 L； IOs ITQ 15s：
[0056] PCR循環(huán)為30個，PCR完后跑1%的瓊脂糖凝膠鑒定，結果見圖2。
[0057] 將上述反應體系擴大10倍，根據(jù)Marker來確定目的基因，切膠回收(步驟參照膠回 收試劑盒）。
[005引 5、目的基因和表達載體的雙酶切
[0059] (I)CPLX 1/2 基因酶切體系（50ul): 目的基因： 30ul 反睦buri'cn 細1
[0060]水； 1〇沾 EcoRi: 2.51x1 BanHI: 2,5 姐
[0061 ] (2)pAAV-ires-GFP載體酶切體系（50ul): 載體： 2:()ui BuiTen 5ul
[0062] 7長; 20ul EcoRJj 2..訊 I BamHi: 2.5 山
[0063] 將上述反應體系置于37°C，過夜或酶切5小時。電泳檢測酶切產(chǎn)物，并切膠回收。 pAAV-ires-GFP載體購自 CE化 BIOLABS公司。
[0064] 6、連接目的基因和pAAV-ires-GFP
[0065] 將上述酶切的目的基因 CPLX 1/2連接到酶切載體pAAV-ires-GFP上形成重組質粒 pAAV-CPLXl/2,同時取酶切的pAAV-ires-GFP和無菌水為陰性對照，按表3配制IOul