一種草分枝桿菌注射液的制備方法及草分枝桿菌注射液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及草分枝桿菌，特別涉及一種草分枝桿菌注射液的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]草分枝桿菌是抗酸分枝桿菌中的一種，基于其同結(jié)核分枝桿菌的生物親緣性，可介入人體的免疫過(guò)程，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫能力。滅活的草分枝桿菌進(jìn)入人體后可刺激T淋巴細(xì)胞釋放出多種淋巴因子如MAF，MIF，MCF，MMF等，這些因子作用于單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，使之向病灶部位聚集、活化，對(duì)病原菌進(jìn)行吞噬、殺傷和清除；同時(shí)，自然殺傷(NK)細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞也活化、增多；IgM，IgG趨正常，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。臨床驗(yàn)證結(jié)果證明，在免疫功能檢查中，T淋巴細(xì)胞亞群，T3，T4，T8，T4/T8明顯增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.001-0.002)，自然殺傷細(xì)胞，免疫球蛋白均明顯變化，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有顯著差異(P<0.01)，具有顯著免疫增強(qiáng)作用。
[0003]對(duì)于草分枝桿菌的免疫增強(qiáng)乃至抗癌功能，目前在藥學(xué)、臨床學(xué)上都進(jìn)行了大量的研究，在文獻(xiàn)DE3728367C1中，披露了用草分枝桿菌對(duì)HIV感染者進(jìn)行免疫接種的方法，改善HIV感染者的生存狀況。
[0004]在《新的免疫增強(qiáng)劑一一草分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)和臨床研究》(實(shí)用癌癥雜志，2003.3，Vol.18，N0.2)—文中，詳細(xì)報(bào)道了臨床上的草分枝桿菌對(duì)Lovo人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用》。
[0005]文獻(xiàn)CN103396958A中，披露了一種動(dòng)物用草分枝桿菌及其免疫增強(qiáng)劑的制備方法，將菌種接種到種子培養(yǎng)基上進(jìn)行種子培養(yǎng)后，直接進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)。這種培養(yǎng)方式雖然在一定程度上保證了菌種的純度及降低了變異幾率，然而，卻也限制了其產(chǎn)量。
[0006]為了擴(kuò)大草分枝桿菌的使用范圍，需要一種能夠工業(yè)化生產(chǎn)的草分枝桿菌注射液的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提出了一種草分枝桿菌注射液的制備方法，包括以下步驟:
[0008]a)將將草分枝桿菌的原始凍干菌種溶解、用稀釋的蘇通培養(yǎng)基稀釋、分裝，完成原始種子批的建立，并在-70攝氏度環(huán)境下保存；
[0009]b)對(duì)原始種子批菌種進(jìn)行檢查，并將合格的原始種子批菌種解凍、過(guò)濾、稀釋、接種于改良羅氏培養(yǎng)基上在30-40攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)120-150小時(shí)；
[0010]c)將步驟b)中獲得的菌體進(jìn)行研磨、稀釋后接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，在30-40攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)168-196小時(shí)，經(jīng)洗脫、研磨、分裝，形成主種子批菌種，并進(jìn)行檢驗(yàn)；
[0011]d)將檢驗(yàn)合格的主種子批菌種接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，在30-40攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)196-240小時(shí)，經(jīng)洗脫、研磨、分裝，形成工作種子批菌種，并進(jìn)行檢查；
[0012]e)將工作種子批菌種通過(guò)復(fù)蘇、擴(kuò)增形成工作種子液，將工作種子液按照體積比1-5%的接種量將工作種子液接種到發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為35-42攝氏度，通氣量為0.5-1.5L/分鐘、以50-300rpm轉(zhuǎn)速的條件下培養(yǎng)360-450小時(shí)，收集之后用0.8-1.0%的NaCl沖洗液進(jìn)行沖洗、過(guò)濾，純化、滅菌之后即獲得草分枝桿菌原液；
[0013]f)以聚山梨酯80和氯化鈉及注射用水混合，過(guò)濾配制成稀釋液，所述稀釋液中聚山梨酯80的體積百分比是0.05-0.4%，氯化鈉重量百分比是0.7-1.1%，其中過(guò)濾之后的稀釋液與草分枝桿菌原液混合，獲得草分枝桿菌藥液；
[0014]g)將草分枝桿菌藥液灌封在清潔滅菌后的安瓿瓶中，終端滅菌檢漏后，即為草分枝桿菌注射液。
[0015]如上所述的制備方法，其特征在于:
[0016]所述蘇通培養(yǎng)基的配方是(單位:g/L):天門(mén)冬素4g、枸櫞酸鹽2g、磷酸氫二鉀0.5g,MgSO4.7H20 0.5g、枸櫞酸鐵銨0.5g、甘油_6ml ；
[0017]調(diào)節(jié)PH值至弱堿性，然后采用濕熱滅菌法進(jìn)行二次滅活，步驟為:
[0018]對(duì)配制好的蘇通培養(yǎng)基在121攝氏度溫度下進(jìn)行滅活處理30分鐘；
[0019]—次滅活完成后的蘇通培養(yǎng)基，在常溫下靜置4小時(shí)，然后以121攝氏度的溫度再次進(jìn)行滅活處理35分鐘，完成二次滅活處理。
[0020]如上任一所述的方法，其特征在于:
[0021]所述改良羅氏培養(yǎng)基的配方是(單位:g/L):
[0022]磷酸二氫鉀2.4、硫酸鎂0.24、檸檬酸鎂0.6、L_谷氨酸鈉7.2、孔雀綠0.4、馬鈴薯淀粉30，并調(diào)節(jié)PH值至弱堿性，然后采用濕熱滅菌法進(jìn)行二次滅活，步驟為:
[0023]對(duì)配制好的改良羅氏培養(yǎng)基在121攝氏度溫度下進(jìn)行滅活處理30分鐘；
[0024]—次滅活完成后的改良羅氏培養(yǎng)基，在常溫下靜置4小時(shí)，然后以121攝氏度的溫度再次進(jìn)行滅活處理30分鐘，完成二次滅活處理。
[0025]如上任一所述的方法，其特征在于:
[0026]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方是(單位:g/L):磷酸二氫鉀1.5、磷酸氫二鈉1.5、硫酸銨0.5、硫酸鎂0.055、硫酸銅0.001、味精0.5、檸檬酸鈉0.45、瓊脂粉15、甘油6、酵母膏5、馬鈴薯淀粉15、葡萄糖5，然后再用濕熱滅菌法進(jìn)行滅活處理，具體方法是:
[0027]將配好的發(fā)酵培養(yǎng)基在121攝氏度溫度下進(jìn)行滅活處理30分鐘。
[0028]本發(fā)明還提出了一種草分枝桿菌注射液，所述草分枝桿菌注射液是由如上任一所述的方法制備而成。
[0029]本發(fā)明所提出的草分枝桿菌注射液的制備方法，適宜于規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，且顯著的降低了成本，能夠充分滿足患者需求。
【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1草分枝桿菌原液的制備流程圖
[0031]圖2從原液到注射液的制備流程圖
[0032]具體實(shí)施方法
[0033]實(shí)施例1
[0034]—、草分枝桿菌原液的制備
[0035]如圖1所示，草分枝桿菌原液采用三級(jí)培養(yǎng)的模式進(jìn)行制備，具體步驟如下:
[0036]原始種子批的建立
[0037]將草分枝桿菌的原始凍干菌種溶解、用稀釋的蘇通培養(yǎng)基稀釋、分裝，完成原始種子批的建立，并在-70攝氏度環(huán)境下保存。
[0038]所述蘇通培養(yǎng)基的配方是(單位:g/L):天門(mén)冬素4g、枸櫞酸鹽2g、磷酸氫二鉀0.5g,MgSO4.7H20 0.5g、枸櫞酸鐵銨0.5g、甘油_6ml ；
[0039]調(diào)節(jié)PH值至弱堿性，然后采用濕熱滅菌法進(jìn)行二次滅活，步驟為:
[0040]對(duì)配制好的蘇通培養(yǎng)基在121攝氏度溫度下進(jìn)行滅活處理30分鐘；
[0041]—次滅活完成后的蘇通培養(yǎng)基，在常溫下靜置4小時(shí)，然后以121攝氏度的溫度再次進(jìn)行滅活處理35分鐘，完成二次滅活處理。
[0042]主種子批菌種的建立
[0043]對(duì)原始種子批菌種進(jìn)行檢查，并將合格的原始種子批菌種解凍、過(guò)濾、稀釋、接種于改良羅氏培養(yǎng)基上在30-40攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)120-150小時(shí)；
[0044]然后將獲得的菌體進(jìn)行研磨、稀釋后接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，在30-40攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)168-196小時(shí)，經(jīng)洗脫、研磨、分裝，