桑葉中降糖小分子活性組分的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)制藥工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種桑葉中降糖小分子活性組 分的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 桑葉，桑科中植物桑的干燥葉，味苦、甘，性寒。在古代，中醫(yī)就以桑葉作中藥治療 消渴癥;現(xiàn)代桑葉也常配伍與中藥復(fù)方應(yīng)用于臨床治療。研究表明，桑葉是上好的功能產(chǎn) 品，具有提高免疫力、降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗肥胖、延緩衰老等功能?，F(xiàn)階段，已分別研 究了桑葉中多糖、生物堿、黃酮等對(duì)降血糖起到較顯著的作用，但桑葉中小分子物質(zhì)對(duì)降血 糖的作用卻很少被報(bào)道。
[0003] 大量研究表明PPARy與2型糖尿病的發(fā)生相關(guān)性很大。PPARy是核受體超家族成 員，被激活后可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化，通過(guò)相關(guān)調(diào)節(jié)使對(duì)胰島素敏感的小脂肪細(xì)胞的數(shù) 量增加，脂聯(lián)素分泌增多，改善胰島素抵抗，使機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性增強(qiáng)，是目前人們研 究抗糖藥物的一種有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)，提供一種低成本、快速、簡(jiǎn)潔地從桑葉中提取具有降糖 活性的小分子組分的方法。
[0005] 為達(dá)到上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] -種桑葉中降糖小分子活性組分的提取方法，該方法包括以下步驟：
[0007] (1)取洗凈并干燥的桑葉，粉碎，得到桑葉粉；
[0008] (2)放入干燥潔凈的容器中，加入蒸餾水，震蕩混勻，然后加熱至75-100 °C煎煮2-4h，過(guò)濾；
[0009] (3)取濾渣重復(fù)步驟(2)1-3次，合并所得濾液，得粗提液；
[0010] (4)在粗提液中加入乙醚進(jìn)行萃取脫脂處理，萃取完成后取上層水液，濃縮至原體 積的 1/2-1/4;
[0011] (5)加入2-4倍體積的無(wú)水乙醇浸提，離心，所得上清液烘干，然后依次用無(wú)水乙 醇、丙酮、乙醚洗滌2-4次，烘干得粗提物；
[0012] (6)在粗提物中加入蒸餾水進(jìn)行復(fù)溶，使用25000-35000分子量的超濾膜進(jìn)行超 濾，收集濾過(guò)液，烘干，得到目的小分子活性組分。
[0013] 所述步驟(2)中桑葉粉或?yàn)V渣與蒸餾水的料液比為1: (20-40) (g/mL)。
[0014]所述步驟(4)中乙醚與粗提液的體積比為1:(10-20)。
[0015]所述步驟(6)中粗提物與蒸餾水的料液比為1: (10-20)(g/mL)。
[0016] 所述步驟(6)中超濾的條件為:室溫20-30°C，驅(qū)動(dòng)壓力0.25MPa。
[0017]本發(fā)明采用水提醇沉法，加上中間步驟的乙醚萃取脫脂，粗提桑葉中的有效活性 成分;然后通過(guò)超濾技術(shù)分離上述初提物，進(jìn)一步獲取桑葉中的小分子活性組分。由于水提 醇沉法得到的上清液含有較多的多糖、蛋白質(zhì)等大分子復(fù)合物，具有較強(qiáng)的吸水性，故單憑 烘干無(wú)法除去其中的水分，會(huì)使沉淀產(chǎn)物含有較多的水分，影響產(chǎn)物性狀(呈膠狀，而非粉 末狀固體)和純度(無(wú)法進(jìn)行精確的定量分析）。醇沉后用無(wú)水乙醇洗滌，除去一部分水分； 再用可溶于水的丙酮洗滌，確保水分除凈;最后用無(wú)水乙醚洗滌沉淀物，除去殘存的乙醇、 丙酮和溶于其中的水分，這樣就可以有效除去醇沉上清中的水分，得到較純的粉末狀粗提 活性組分，以利于工業(yè)化大規(guī)模進(jìn)一步地分離純化。采用超濾技術(shù)分離上述粗提活性組分 得到的小分子活性組分，運(yùn)用Hela高通量細(xì)胞篩選模型，檢測(cè)其有效組分活性，結(jié)果顯示其 含有PPAR γ配體的激活效應(yīng)，能激活PPAR γ信號(hào)通路，可作為PPAR γ激活劑，且安全有效， 毒性較低，不會(huì)引起并發(fā)癥。
[0018] 本發(fā)明提供了一種低成本、快速、簡(jiǎn)潔地提取桑葉中活性小分子組分的方法，該活 性小分子組分被證明可作為抗糖尿藥物的有效活性組分，且安全有效，毒性較低。本發(fā)明適 用于活性小分子抗糖尿藥物的提取，可有效降低降糖活性小分子藥物的成本，且方法簡(jiǎn)便， 能夠有效滿足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)需求。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述。應(yīng)該指出，以下具體說(shuō)明都是例示 性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ) 具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
[0020] 實(shí)施例1:桑葉中降糖小分子活性組分的提取
[0021] 1.桑葉中有效成分的粗提
[0022] (1)稱取洗凈并干燥的桑葉50g，粉碎，得到桑葉粉；
[0023] (2)放入干燥潔凈的錐形瓶中，加入1L蒸餾水，即料液比1:20(g/mL)，震蕩均勾，將 樣品于100°C煎煮2h，過(guò)濾；
[0024] (3)取濾渣按步驟(2)重復(fù)提取2次，合并所得濾液，得粗提液；
[0025] (4)在粗提液中加入200mL乙醚進(jìn)行脫脂處理，離心，留濾液，濃縮至原體積的1/4;
[0026] (5)加入3倍體積的無(wú)水乙醇浸提，靜置過(guò)夜，離心，取上清液初步烘干，然后用無(wú) 水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌3次，烘干，稱重，初提物的得率為9.24%。
[0027] 2.超濾技術(shù)提取初提物中的目的小分子有效成分
[0028]加適量水復(fù)溶初提物，粗提物與蒸餾水的料液比為1:10(g/mL)，使用30000分子量 的超濾膜，在25°C的溫度下，驅(qū)動(dòng)壓力為0.25MPa進(jìn)行超濾，截留初提物中的多糖、蛋白質(zhì)等 大分子物質(zhì)，取濾過(guò)液，烘干，為目的小分子組分，計(jì)算得率為60 %。
[0029]實(shí)施例2:利用Hela細(xì)胞模型檢測(cè)目的小分子組分活性
[0030]將得到的目的小分子組分用DMS0溶解，配成5g/L的樣品，運(yùn)用Hela高通量細(xì)胞篩 選模型檢測(cè)樣品活性的高低。結(jié)果如表1所示。
[0031 ]表1提取樣品與羅格列酮激活倍數(shù)的比較
[0033]實(shí)施例3:利用Hela細(xì)胞模型檢測(cè)目的小分子組分活性
[0034]在得到的目的小分子組分中混入2%的殼寡糖，然后用DMS0溶解，配成5g/L的樣 品，運(yùn)用Hela高通量細(xì)胞篩選模型檢測(cè)樣品活性的高低，活性并未見(jiàn)明顯變化。結(jié)果如表2 所示。
[0035]表2含殼寡糖樣品與羅格列酮激活倍數(shù)的比較
[0037] 由以上實(shí)施例可知，本發(fā)明可以簡(jiǎn)潔、快速地獲取桑葉中PPARy激活劑，并且安全 有效，較羅格列酮毒性低，可應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)抗糖尿藥物中。接下去我們將大規(guī)模制備該 抗糖尿小分子活性組分，并進(jìn)一步分離純化，以獲得高純度的抗糖尿小分子活性物質(zhì)，并進(jìn) 一步研究其抗糖尿作用機(jī)理或作用途徑，為人類的健康貢獻(xiàn)微薄力量。
[0038] 以上所述，僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明的核心技術(shù)的前提下，還可以做出改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 屬于本發(fā)明的專利保護(hù)范圍。與本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都 應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種桑葉中降糖小分子活性組分的提取方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 取洗凈并干燥的桑葉，粉碎，得到桑葉粉； (2) 放入干燥潔凈的容器中，加入蒸餾水，震蕩混勻，然后加熱至75-100°C煎煮2-4h，過(guò) 濾； (3) 取濾渣重復(fù)步驟(2) 1-3次，合并所得濾液，得粗提液； (4) 在粗提液中加入乙醚進(jìn)行萃取脫脂處理，萃取完成后取上層水液，濃縮至原體積的 1/2-1/4; (5) 加入2-4倍體積的無(wú)水乙醇浸提，離心，所得上清液烘干，然后依次用無(wú)水乙醇、丙 酮、乙醚洗滌2-4次，烘干得粗提物； (6) 在粗提物中加入蒸餾水進(jìn)行復(fù)溶，使用25000-35000分子量的超濾膜進(jìn)行超濾，收 集濾過(guò)液，烘干，得到目的小分子活性組分。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑葉中降糖小分子活性組分的提取方法，其特征在于:所述步 驟(2)中桑葉粉或?yàn)V渣與蒸餾水的料液比為1: (20-40)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑葉中降糖小分子活性組分的提取方法，其特征在于:所述步 驟(4)中乙醚與粗提液的體積比為1:(10-20)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑葉中降糖小分子活性組分的提取方法，其特征在于:所述步 驟(6)中粗提物與蒸餾水的料液比為1: (10-20)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑葉中降糖小分子活性組分的提取方法，其特征在于:所述步 驟(6)中超濾的條件為:室溫20-30 °C，驅(qū)動(dòng)壓力0 · 25MPa。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種桑葉中降糖小分子活性組分的提取方法，包括以下步驟：取桑葉粉碎，得桑葉粉；桑葉粉中加入蒸餾水，震蕩混勻，在75-100℃煎煮2-4h，過(guò)濾，取濾渣重復(fù)1-3次，合并濾液得粗提液；粗提液中加入乙醚萃取脫脂，完成后取上層水液并濃縮至1/2-1/4；加入無(wú)水乙醇浸提，離心，取上清液烘干，然后依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，烘干；加入蒸餾水復(fù)溶，25000-35000分子量超濾膜超濾，收集濾過(guò)液，烘干，得到目的小分子活性組分。本發(fā)明提供了一種低成本、快速、簡(jiǎn)潔地提取桑葉中活性小分子組分的方法，該活性小分子組分被證明可作為抗糖尿藥物的有效活性組分，且安全有效，毒性較低。
【IPC分類】A61P3/10, A61K127/00, A61K36/605
【公開(kāi)號(hào)】CN105616504
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610115139
【發(fā)明人】呂正兵, 舒建洪, 白靜, 李倩, 宋如鋆, 任飛
【申請(qǐng)人】杭州蠶寶生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2016年3月1日